瘢痕成纤维细胞培养（转）

取材和保存

为了进行对比性研究，宜同时分别从不同部位采取正常皮肤组织和瘢痕组织。正常皮肤组织可以从临近正常部位和臀部等既不易长瘢痕而又较为隐蔽的部位采取。正常皮肤和瘢痕组织均应切取全层，刮除皮下脂肪，放入有培养液的小瓶内。得到标本后便可进行无菌操作接种。若不能立即进行培养，可将标本放入4oC冰箱保存，但不超过48h进行原代培养。

原代培养

1.  先将组织用含100U/ml，链霉素100ug/ml得PBS或Hank’s液清洗2次;适量清洗
2.  用眼科剪或解剖刀仔细刮除表皮，或用剥脱剂Dispase剥脱表皮。然后再用PBS或Hank’s液清洗2－3次;
3.  将标本用眼科剪剪碎，使之成为0.5－1mm3得组织块，用PBS或Hank’s液清洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止；
4.  将组织块放入培养瓶留置30min，以使组织块干燥并贴附于培养瓶表面，或将组织块按适当间隔放置在涂有大鼠鼠尾胶原得培养瓶中使其固定。
5.  .加入含10%－20%（20%）的胎牛血清或小牛血清McCoy’s-5A培养液或DMEM培养液，放入5%CO2、37oC温箱。3－4天内不要观察和翻动，以免影响组织块的贴瓶及生长，1周后每天更换培养液1－2次。
6.  组织块接种后4－7天开始长出细胞当成纤维细胞呈若干大片的、密集的细胞集落时，或是成纤维细胞铺满瓶底时，便可进行传代培养。


传代培养

1．  传代时将瓶内的培养液弃去，用PBS液洗2次，加入胰酶-EDTA（浓度的大小）消化液少许，轻轻摇动，使之浸润整个瓶底，置于37oC温箱消化3－5min。（消化，注意时间的控制）（漂洗后加入0.5％的胰蛋白酶消化约1min，镜下见胞质回缩、细胞间隙增大时加入DMEM液终止消化）
2．  然后再培养瓶内加入新鲜培养液，用滴管将细胞从瓶壁上轻轻地吹打下来，使之成为细胞悬液。
3．  根据细胞的数量将细胞悬液分转到新的培养瓶内，加入新鲜培养液。25ml的培养瓶大约接种25万个细胞。（注意细胞数目的估计）
4．  当细胞长满瓶壁后，同法将细胞转入新的培养瓶。
5．  从细胞开始生长到第一代传代，大约需要1－2个月的时间。以后视细胞生长的快慢，大约每7－10d传代一次，每3－4天换液一次。

注意事项

1.  外科手术切取标本时，宜用75％酒精消毒，若是用碘酒消毒，标本取后宜用PBS或Hank’s液清洗以尽可能去掉碘，因碘对细胞有毒性作用，影响细胞生长
2.  一定要彻底去除表皮（用眼科剪或解剖刀仔细刮除 或用表皮剥脱剂Dispase剥脱）和脂肪，因为残留表皮很快生长繁殖，夺取成纤维细胞生长所需要的培养液中的营养，从而干扰成纤维细胞的生长。脂滴会污染培养液和培养瓶，使组织块难以贴壁和生长。
3.  必须严格执行无菌操作(采取、保存、去除表皮、修剪、及培养过程中)，培养的细胞无论再哪个阶段发生污染，均需要中止培养，重新试验。
4.  取材部位的选择：前胸、耳廓口周及下颌等部位较容易生长 且较为厚硬，硬眼睑、红唇、臀部以及空强器官粘膜等部位较少生长。取瘢痕和瘢痕疙瘩的中心部位
切取的厚度及处理：正常皮肤（瘢痕四周1cm外）及瘢痕均应切除全层，刮除皮下脂肪。将取下的组织在无菌的条件下，尽快移至盛有DEME的密封容器内，置冰箱冷藏箱4oC温度条件下，在不超过48h内进行原代培养。
5.使用培养皿原代，将培养皿放于5%CO2温箱中，其温度、湿度及氧气供应接近人体生理环境，有利于成纤维细胞生长，但由于不能完全封闭盖口，因而细菌或霉菌等感染机会多，培养瓶充气后密闭瓶口观察培养液的PH变化，以保持适宜的酸碱度。应根据经验和实验方法从优选择。


细胞形态

原代培养 ：界限较清楚，细胞体积较大，成棱形或不规则三角形，细胞质向外伸出2－3个长短不同的突起，细胞核呈圆形或长椭圆形，两者细胞（正常皮肤和瘢痕）的形态和大小均无明显差异（还包括动力学、形态学、生长特性）。但细胞融合后正常皮肤成纤维细胞生长排列较规则多呈放射状、编织状或漩涡状走行、瘢痕疙瘩成纤维细胞排列则较紊乱，极性消失，有明显的交叉重叠现象。
传代培养：细胞贴壁伸展后体积变打，细胞由圆形伸展为多行性，此后细胞分裂开始，可见双核和多核细胞。

人皮肤瘢痕组织原代培养：原代第五天的细胞图片
1.细胞种类：人成纤维细胞
2.培养的天数：5d;细胞倍增时间-：12－36h左右；
3.放大倍速：100倍
4.培养基种类：DMEM＋20%胎牛血清；
5.细胞状态与特征简述:细胞呈细长梭状生长，贴壁细胞