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博士过关考试题库
1. 举例说明图位克隆的方法、过程及优缺点。
图位克隆法是分离克隆基因的一种方法，首先要构建一个覆盖目的基因区域的精密分子标记遗传连锁图，并以此为基础进一步制作覆盖目标基因区域的物理图谱，获得包含目的基因的克隆及候选基因，最后通过转化验证。
用图位克隆法克隆目的基因，有以下几个个步骤：第一步是群体的构建和定位，它包括目的基因的染色体定位（初步定位，找到与目的基因紧密连锁的分子标记）和精细定位（将基因定位于一个非常狭小的区段内）。这一步工作做的越细，后面的工作越容易。例如：水稻抗稻瘟病基因Pib的克隆（Wang et al. 1999），仅感病单株就用了3305株。利用这些单株将基因定位于0.06cM的区段内，如此狭窄的区段，可直接利用小片段的Cosmid文库覆盖这一区域，大大缩短了后续工作的时间，减少了工作量。此外，若所用的物种在该区段已有大量的分子标记定位或一张高密度连锁图（如拟南芥、水稻），会大大加快工作进度。第二步用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选大片段基因组文库（YAC或BAC文库），以阳性克隆末端及其亚克隆进行染色体步查，构建覆盖目的基因区域的物理图谱，获得含目的基因的克隆；这一步对第一步的工作和所用物种依赖性极大。第三步候选基因的鉴定及其结构和生物学功能的分析。基因鉴定工作，一般有两种方法－转化互补法和突变体的利用法。应用较多的是前者，主要是将所分离的显性•基因转入隐形受体中，一般需要花费较多的时间。后者需要较多的待分离基因的突变体，只要鉴定出所分离的基因在所有的突变体中也发生了突变，就可认为所分离的基因是目的基因。
优缺点：好处：分离性状简单稳定的条件下，理论上任何一个基因都可以分离得到，工作基础比较扎实，可以按部就班的进行。缺点：（1）仅适合于小基因组物种；（2）工作量巨大；（3）目的基因区域的精细遗传图谱的完成是图位克隆的前提，群体的构建非常关键，要用一到多个群体；（4）必须构建多种文库（基因组文库、cDNA文库等）；（5）必须有连锁非常紧密的分子标记；（6）目的基因所控制的性状必须容易识别，受环境因素影响小。
2. DNA芯片技术。基因芯片、蛋白质芯片的制作方法、原理和检测方法。高通量表达谱分析有哪几种。
当前,完整的人类基因组序列即将译解,“分子生物学时代”正在转变为“基因组生物学时代”。面对大量的信息,近年来发展了多种分析基因表达差异的高通量技术，分析方法主要包括：
表达序列标签(EST)比较测序; 基因表达系列分析(SAGE)；
cDNA芯片； 消减克隆, 如代表性差异分析(RDA);
差异展示(DD) differential display ； DNA芯片；
质谱 2－D PAGE
蛋白质芯片
DNA芯片技术、基因芯片、蛋白质芯片的制作方法、原理和检测方法。
根据芯片上的固定的探针不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、DNA芯片，目前制备芯片的方法基本上可分为两大类：一类是原位合成(in situ Synthesis)；一类是合成后交联(post-synthesis attachment)。它包括化学喷射法、接触式点涂法。合成点样法虽然芯片上探针的密度相对较低，每个样品都要预合成、纯化，在芯片制备前还需妥善保存合成的探针，但是它的最大优点是操作简便。其中，接触式点涂法的优点是探针密度比较高，缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长；缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常只有1平方厘米400点。
其基本原理和检测方法如下：
采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记（荧光、地高辛、生物素）的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析。
3. 简答：
SSH抑制性差减杂交
差异表达cDNA(目标)存在于检测子cDNA中而在驱赶子cDNA中缺失或丰度较低。检测子与驱赶子双链cDNA首先用四碱基限制性内切酶消化产生平末端。再把检测子cDNA片断分成两份（1和2）分别与接头1和接头2连接，形成两组检测子，（1）和（2）。接头的末端无磷酸基团消化，那样每个接头中只有较长的链才能共价结合上cDNA的5΄端。
SSH技术用了两次杂交，第一次中把过量的驱赶子加到每份检测子样品中。然后将样品热变性并退火。检测子单链cDNA片断（a）被均化，即平均高、低丰度的cDNA浓度，使其基本相等。均化的发生是因为据杂交的二级动力学（19），重退火过程中高丰度分子能更快产生同源杂交cDNA(b)。而且，检测子的单链cDNA(a) 片断中差异表达基因的cDNA被显著富集，而 “共有的”非靶标cDNA与驱赶子形成异源杂交体。
在第二次杂交中，经过第一次杂交的两份样品被混合。只有保持均化并消减的检测子cDNA能重新结合形成（b）,(c)和新的（e）杂交体。这一阶段加入的第二部分变性驱赶子进一步定集了差异表达基因的部分（e）。新形成的（e）杂交体具有能区分于第一、二次杂交中形成的杂交体（b）和 (c)的重要特征，就是其在5΄端有不同的接头序列，一者来自于样品1，一者来自于样品2。这两个序列使得在PCR中用P1和P2这对各自对应于接头1和2外部的引物时，可以优先扩增消减和均化的片断（e）。要完成选择性扩增，在PCR进程前需进行一个延伸反应补平这些分子粘性末端，以便于引物退火。
在所有PCR循环中，只有（e）型分子才能被指数级扩增。（b）型分子因含有长反转重复序列末端，而在每次变性－退火PCR步骤后形成稳定的“锅柄样”结构。“锅柄样”结构不能作为指数级PCR的模板，因为长接头序列的分子内退火比短得多的PCR引物与模板间的分子间退火要更优先和稳定（14，15）。这就是抑制性PCR的效应。而且，（a）型和（d）型分子不含引物结合位点，（c）型分子只能以线性速率被扩增。只有（e）型分子在其末端具有不同的接头序列，使其能够在PCR中得到指数级扩增。描述（e）片断形成过程和富集率的数学模型与计算将另行给出（20）
转座子
DNA的转座，或称移位（transposition），是由可移位因子（transposable element）介导的遗传物质重排现象。已经发现\"转座\"这一命名并不十分准确，因为在转座过程中，可移位因子的一个拷贝常常留在原来位置上，在新位点上出现的仅仅是拷贝。因此，转座有别于同源重组，它依赖于DNA的复制。
a. 简单转座子
转座子（transposon，Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。
最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（insertion sequence，IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。IS序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白
b.复合式转座子（composite transposon）是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。
转座作用的机制
转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的（3-12bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。不同转座子的靶序列长度不同，但对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度都是一样的，如IS1两翼总有9个碱基对的靶序列，而Tn3两端总有5bp的靶序列。
转座可被分为复制性和非复制性两大类。在复制性转座中，所移动和转位的是原转座子的拷贝。转座酶（transposase）和解离酶（resolvase）分别作用于原始转座子和复制转座子。TnA类转座主要是这种形式。在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以这种方式进行转座。
转座作用的遗传学效应：① 转座引起插入突变;② 转座产生新的基因;③ 转座产生的染色体畸变;④ 转座引起的生物进化.
应用研究：利用转座子插入突变效应研究基因结构和功能；分离克隆基因；利用TN进行基因定位；IR作为基因的转移的载体；
平衡化CDNA文库——：基于复性动力学理论，通过变性———复性操作，使不同表达丰度的基因趋于一致；使用这种方法构建的CDNA文库就是平衡化CDNA文库。这类方法，操作简单，设备试剂要求比较低，均一化程度较好
RAPD——random amplified polymorphism DNA用任意引物进行基因组指纹分析是检测DNA多态性的一种通用方法，对遗传学、图谱绘制、系统发育学和种子群生物学都很有用
AFLP（有何用途）——amplified fragment length polymorphism，它是通过对基因组DNA 进行限制性酶切切割形成的许多限制片段加以双链接头，作为进一步扩增的模版，根据接头序列在末端再加上1-3各选择性碱基而设计引物，只有那些与引物很好配对的片段得到扩增，扩增产物在高分别率的变性聚丙烯酰氨上电泳而加以分开而被检测。可检测50-100各位点，这便可以作为遗传图谱与物理图谱中的路标，同时可以检测群体基因组和克隆DNA片段，为遗传和物理图谱之间构建一个桥梁。
SOUTHERN，WESTERN，NORTHERN方法及用途。
抽提DNA，酶解，电泳，转移，杂交，放射自显影
SOUTHER主要用于分析基因的结构（缺失、突变等）、RFLP、基因同源性及其拷贝数的分析
NORTHERN主要用于检测特异的mRNA，分析该基因的表达情况，mRNA的大小。
已知N端序列，如何获得该基因并体外表达。已经在植物中获得蛋白质生长因子，怎么样克隆这个基因并在大肠杆菌中表达。若欲从哺乳动物中克隆一个编码蛋白质生长因子的基因并使之在大肠杆菌中表达，说明主要步骤，并简要说明可能遇到的问题（启动子、密码子、剪切和分泌）及解决的方法（已知该蛋白质生长因子的N末端氨基酸序列）（合成寡核苷狻酸探针或者设计简并PCR引物从CDNA文库中筛选或者利用抗体从CDNA文库中筛选相应的克隆）
4. 从蛋白质和核酸复杂程度说明蛋白质组研究比核酸研究难。
与基因组相比蛋白质组具有多样性和可变性。对一个机体而言,基因的数目是恒定的,而蛋白质的种类和数目在同一个机体的不同细胞中各不相同,即使同一细胞在不同的时期,不同条件下,其蛋白质表达也不同。虽然可以通过cDNA 芯片等方法显示生物体的基因启动状况,但mRNA 水平(包括mRNA 的种类和含量) 并不能完全反映出蛋白质的表达[3] 。另外从研究手段方面来说,蛋白质研究技术比基因技术相对要复杂和困难,不仅氨基酸残基数量多于核甘酸残基,而且在蛋白质组研究中没有一种方法象PCR 那样能迅速扩增目的片段,这样对于那些含量很低但对细胞功能起重要作用的蛋白质很难进行大规模的研究
氨基酸残基种类远多于核苷酸残基，蛋白质有着复杂的翻译后修饰，如磷酸化和糖基化等，给分离和分析蛋白质带来很多困难。此外，通过表达载体进行蛋白质的体外扩增和纯化也并非易事，从而难以制备大量的蛋白质。
5. 中心法则的意义、原则及发展。修订和补充。
所谓遗传信息，是指核酸中的碱基序列以及蛋白质中的氨基酸序列。生物的全部遗传信息均包含于 这种大分子的遗传信息中。序列假说是中心法则的核心，中心法则是序列转换的原则
中心法则体现的基本原则：遗传信息的唯一性，遗传物质的自决性，信息表达的单程性，序列转换的共线性
Reverse transcription Temin H.m Nature 1970 (226):1211
Splitting gene Phillip Sharp . 1977
Discontinuous transcription Borst P. Ann Rev.Biochem. 1986 (55):701
Untranslated sequence Huang W.M. Science 1988 (239): 4843
RNA alternative splicing ChristopherW. Ann.rev.Genet.1989(23) :527
RNA editing Cech T.R.Cell 1991 (64): 667
Protein as template for peptide synthesis Lipmann F.Ann. Rev. Biochem1984 (53): 1
Intein/extein 1900
Prion Prusiner S.B. Science 1991 (252): 151
a. 蛋白质的遗传信息并不一定来自核酸： DNA/RNA与protein间序列的非共线性
Post-translation processing
b. RNA中的遗传信息并不一定来自DNA：Intron 、Poly(A)与DNA模板无法对应，RNA editing (Cryptogene)
c, DNA是遗传信息的主要源头，但不是唯一的源头： Prion 作为蛋白质病毒的繁殖是将自身（PrP CS）的分子结构信息通过与正常蛋白（PrPC）的结合， 在分子伴侣的辅助下，传递给PrPC 并其转化为PrPCS的过程
6. 至少举出3点转基因育种的分子生物学原理。
构成生物大分子的单体是相同的，共同的核酸语言，共同的蛋白质语言（核苷酸是遗传物质，控制着性状的表达；遗传密码的通用性）；
生物遗传信息表达的中心法则相同
稳定遗传；
植物细胞的全能性
7. 转录因子的结构和功能。提出一个克隆并研究其功能的技术路线。
结构：A. DNA-binding domain
B. Transcription activation domain
C. Ligand-binding domain (dimerlization domain)
D. Intracellular trafficking signal（NLS）
E. Protein/protein interaction domain
功能：Transcription Factors May Bind to More than One Sequence with Different Affinities
Transcription Factors Influence Transcription Through Protein-Protein Interactions
A. A transcription factor may interact with another transcription factor before or as it binds to DNA, in a variety of functional contexts.
B. A transcription factor bound to DNA may physically inhibit binding of a different transcription factor to a nearby site.
C. A transcription factor bound to DNA may alter chromatin structure.
D. A transcription factor bound to DNA may stabilize the bending or looping of DNA.
E. A transcription factor bound to DNA can interact with components of the basal transcriptional machinery, facilitating or inhibiting its association with the basal promoter and resulting in an increase or decrease in overall transcription rates.
8. 举出目前3个已经完成或基本完成测序的真核生物。
1997,酿酒酵母（S.cerevisiae）12Mb，6000 genes；
1998,C.elegans,19 Mb,19099 genes
2000,Drosophila,138 Mb,13601 genes
2001,人类31.647亿bp，3-3.5万genes；Arabidopsis thaliana,125 Mb,25498 genes
2002.4,水稻(Oryza sativa L.)，whole genome shotgun,indica-466 Mb,46022-55615 genes; japonica-420 Mb,32000-50000 genes
2002,河豚fugu rubripes 330 Mb;
2002.12，mouse，2.5亿bp ，30000 genes，99% having direct counterpart to human;
mosquito;
简述人类和拟南芥基因组研究的进展。
继2001年６月２６日科学家公布人类基因组“工作框架图”之后，中、美、日、德、法、英等６国科学家和美国塞莱拉公司2002年2月１２日联合公布人类基因组图谱及初步分析结果。来自中国科技部和中国科学院的消息说，这次公布的人类基因组图谱是在原“工作框架图”的基础上，经过整理、分类和排列后得到的，它更加准确、清晰、完整。对它的初步分析表明，人类基因组由３１．６４７亿个碱基对组成，共有３万至３．５万个基因，比线虫仅多１万个，比果蝇多２万个，远小于原先１０万个基因的估计。另外，科学家还发现与蛋白质合成有关的基因只占整个基因组的２％。１９９０年，被誉为生命科学“登月计划”的国际人类基因组计划启动，主要由美、日、德、法、英等国的科学家共同参与。１９９９年９月，中国积极加入这一研究计划，负责测定人类基因组全部序列的１％，中国因此成为参与这一研究计划的唯一发展中国家。美国塞莱拉公司１９９８年开始人类基因组测序工作，2001年６月２６日也公布了人类基因组草图。
2003.1，Chromosome 14 has been completely sequenced by a team of French and American scientists with the elimination of gaps and inconsistencies present in the draft sequence of the human genome published in February 2001. With more than 87 million nucleotides, this is the fourth and largest human chromosome finished to the high quality specified by the Human Genome Project. Others completed thus far are 22, 21, and 20, which were published in December 1999, May 2000, and December 2001, respectively
9. 完成全基因测序，对于读懂这部生命的天书有何帮助，用动态发展的眼光评说。有人将生物全基因组序列比作“天书”，以你所熟悉的生物为例，谈谈你将如何破译这部天书。
就以本实验室的各种技术平台来举例:基因的识别和证实；功能信息的获取和证实；表达谱的绘制；基因功能的改变；蛋白质水平上基因互作的探测
10. 生物信息学的内容，主要数据库，哪些分析方法。
生物信息学是一门交叉科学，它包含了生物信息的获取、处理、存储、分发、分析和解释等在内的所有方面，它综合运用数学、计算机科学和生物学的各种工具，来阐明和理解大量数据所包含的生物学意义。
在DNA序列方面有GenBank、EMBL和DDBJ等。在蛋白质一级结构方面有SWISS-PROT、PIR和MIPS等。在蛋白质和其它生物大分子的结构方面有PDB等。在蛋白质结构分类方面有SCOP和CATH等。
研究内容：序列比对（Alignment）。结构比对；蛋白质结构预测，包括2级和3级结构预测；计算机辅助基因识别(仅指蛋白质编码基因)；非编码区分析和DNA语言研究；分子进化和比较基因组学；序列重叠群（Contigs）装配；遗传密码的起源；基于结构的药物设计；其他如基因表达谱分析，代谢网络分析；基因芯片设计和蛋白质组学数据分析等，逐渐成为生物信息学中新兴的重要研究领域。
BLAST，GENSCAN，PRIMER DESIGN，CLUSTER，……
11. DNA作为遗传物质的发现过程及证据
GRIFFITH（1928）发现，用热杀死的S型细菌和活的无毒的R型细菌注射到小鼠中，不仅很多小鼠因败身症而死亡，而且从它们的心脏血液中找到了活的S型细菌。活的R形细菌，或死的S型细菌分别注射时，都不引起败血症，这说明用热杀死的S型细菌把某些R型细菌转上化为S型细菌，S型细菌有一种物质或转化因素能够进入R型细菌有一种物质或转化因素能免进入R细菌，并引起稳定的遗传变异。
1944年Avery和同事把DNA、蛋白质和荚膜物质从活的S型细菌和中抽提出来，分别跟少原R的型细菌混和，悬浮在合成培养液中。发现有且只有DNA组分能够把某一R型的细菌转变为S型，而且DNA的纯度越高，这种转化过程愈加有效。
FOX-ALLEN（1964）在肺炎双球菌中，BLDNER-GANEWEN（1964）在枯草杆菌中，用同位素标记供体DNA进行转化实验，都证明了这一点。
12. DNA的结果阐明于上世纪中叶，获诺贝尔奖，请说出该奖的基本内容（即DNA基本结构），获奖人，年份，试叙该发现对生命科学的发展和以DNA为基础的现代生物产业形成的意义。
Watson and Crick，1953年提出的DNA反向双螺旋模型与Wilkins共享1962年诺贝尔生理医学奖，后者通过对DNA分子的X射线衍射研究证实了Watson 和 Crick的模型。
每一单链具有5—3的极性；两条单链间以氢键连接；两条单链极性相反，反向平行；以中心为轴，向右盘旋（B-FORM）；双螺旋中存在大沟（2.2nm）小沟（1.2nm）。
13. 说明比较基因组学的研究方法及近年来的主要进展。
比较基因组学研究方法有两大支柱, 即比较作图和比较生物信息学。比较作图就是利用共同的遗传标记（主要是分子标记、基因的cDNA克隆以及基因组克隆）对相关物种进行物理或遗传作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布情况，提示染色体或染色体片段上的同线性（synteny)或共线性（collinearity），从而对不同物种的基因组结构及基因组进化历程进行精确分析。基因组比较作图的研究，不仅提示了同属甚至同科物种基因组间的同源性和差异性，对不同物种在起源、演化过程中的变化的研究具有巨大的启示作用，而且结束了过去植物基因组研究主要由各物种的经济价值而确定的、局限于各个物种的分散研究系统，使得不同领域的研究工作得以有机地互相补充，建立跨越物种的大遗传系统。因此，比较作图已成为近年来植物基因组学研究的重要内容。比较作图的分子基础是物种间DNA序列尤其是编码序列的保守性。水稻、玉米等一些重要的植物的遗传图谱和物理图谱日益趋向高分辨率、高精确度等方面的迅速发展，为植物比较作图奠定了重要的基础。比较遗传作图是利用一个种的基因或者基因的部分片段或者遗传标记，通过遗传学的方法在其他的物种中寻找其同源顺序及构建相应的遗传标记图。1995年，Nagamura等用水稻cDNA标记延伸因子eFF2同源顺序（elongation factor eFF2 homologue）对大豆、高粱、拟南荠菜等16种植物进行杂交，结果发现均存在同源性序列。Devos等进一步研究还发现，水稻中存在与许多拟南芥的同源基因。比较遗传作图还可以了解更多的各种植物中可供利用的遗传标记，这对遗传研究较为滞后的植物来说尤其重要，如1994年Jena 等构建了栽培稻与药用野生稻的分子标记比较遗传图，用栽培稻的RFLR遗传标记建立了药用野生稻的RFLP遗传图，这是根据不同物种间基因组的同线性原理进行的，既有基因组成的依据，又从分子进化角度体现了二者之间的亲缘关系，可以说是植物比较作图的进步。在此原理基础上，Kennard等也成功地构建出水稻与来源于北美洲的野生稻Zizania palustris L的RFLP的比较遗传图，并且发现在野生稻与栽培稻之间不仅存在着高度保守性，而且在栽培稻11条染色体（第12染色体除外）中还普遍存在着与Zizania palustris L具有共线性的标记。随着比较作图的研究不断深入，植物的比较作图已经发展到对细胞器中的较小的基因组的分析。最近，Ishii 和 McCouch对栽培稻、药用野生稻、澳洲野生稻、小粒野生稻、宽叶野生稻、马来野生稻、玉米、小麦、高粱、大麦、燕麦和蔗糖等15种禾本科作物的叶绿体基因组微卫星DNA通过设定的引物扩增的结果也表明，在禾本科的叶绿体基因组的微卫星DNA中也存在着微同线性。
植物比较物理作图主要有两种方法，一是对同源顺序的序列分析，通过分析它们的相似性来研究不同物种分子系统进化过程和解读基因序列；另一种是比较原位杂交定位，这是由于不同物种的同线性片段在染色体上的真实位置、片段间在染色体上距离的远近、片段分布的染色体区域（如近着丝粒、臂的中部或端部等）、非同线性片段与同线性片段如何穿插分布以及在细胞水平上种间核型的进化特点等，只有通过染色体比较原位杂交定位才能直观地阐明，所以比较原位杂交物理作图已成为植物比较作图中一个越来越重要的研究领域。
比较作图的研究意义在于：一、根据不同种的基因组基因及其排列顺序的高度保守特点绘制而成的比较图，可以研究和探明它们的进化线索。二、解读基因组序列，即通过同源性比较来推测未知基因的功能。三、促进基因作图。由于不同生物的同源基因的相似性，大基因组的遗传信息可以通过研究较小的相关基因组而得到，基因组小的植物物种有利于对直向的同源基因（ortholongus gene）进行基于图谱的克隆
简述蛋白质组的概念和蛋白质组研究的目的意义和基本方法。
蛋白质组(proteome) 是指一个基因,一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组学研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体,从而揭示和说明生命活动的基本规律。蛋白质组学可以分为三个领域: ①蛋白质的大规模的分离与鉴定,以及它们的表达后修饰; ②蛋白水平的差异显示; ③运用当前的一切手段研究蛋白质与蛋白质之间的相互关系。目前,蛋白质组学研究是以二维凝胶电泳蛋白质分离识别技术和质谱分析鉴定技术两大技术为核心。
二维凝胶电泳以等电聚焦(isoelectric focusing , IEF) 为第一向胶,根据蛋白质等电点(PI) 不同而将之分离。最早是采用载体两性电解质PH 梯度等电聚焦,而现在一般采用固向化PH 梯度(immobilized PH gradients , IPG) 等电聚焦。第二向凝胶是SDS-PAGE 根据蛋白质分子质量不同来分离蛋白质的方法。质谱技术的基本原理是将样品离子化后,根据不同离子间质荷比(m/ z) 的差异来分离并确定分子量。做过双向凝胶电泳的人一定会抱怨它的繁琐、不稳定和低灵敏度等缺点。发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法已成为蛋白质组研究技术最主要的目标。目前，二维色谱 (2D-LC)、二维毛细管电泳 (2D-CE)、液相色谱－毛细管电泳 (LC-CE) 等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。另一种策略则是以质谱技术为核心，开发质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用 (CE-MS)等新策略直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物。
蛋白质芯片它类似于基因芯片,是将蛋白质点到固相物质上,然后与要检测的组织或细胞等进行“杂交”,再通过自动化仪器分析得出结果。这里所指的“杂交”是指蛋白与蛋白之间 (如抗体与抗原) 在空间构象上能特异性的相互识别。高通量；灵敏度高；高准确性 运用：
研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用,筛选新的蛋白质。蛋白质芯片能够用于现在其它方法不能检测到的,如蛋白质--药物、蛋白质--脂质之间的相互作用。蛋白质组芯片还可用于检测蛋白与小分子物质的作用,例如蛋白质与DNA ,RNA 分子等。还可以用于药物基因组学,筛选药物的靶分子,以及疾病的诊断,筛选与疾病相关的特异性蛋白标志。
制作方法总的来说分为两类:
一种是将菌液直接点在固相物质上如聚偏二乙烯二氟(PVDF) ,尼龙膜上。用机械人技术,把人类胎儿脑cDNA 表达文库(hEx1) 点阵在酶标板上,然后把细菌群体定格在聚偏二乙烯二氟(PVDF) 过滤膜上,诱导融合蛋白的原位表达并应用抗体进行鉴定。而后又把这种方法进一步发展,应用一个装有一个平台的点样机械手来自动点细菌融合物形成蛋白质芯片。
另一种是先将蛋白纯化后,在通过化学物质偶连到固相物质上。有人先把玻片用乙醛处理,然后把融合蛋白通过N 端的起始胺或蛋白的其它残基与载玻片相连。而Zhu 等则是将蛋白点在涂镍的载玻片上, 再把融合蛋白通过HisX6 尾连到玻片上 。
14. 举例说明真核生物RNA选择性剪切对基因表达调控的作用。（旧分子生物学讲168页）
1. 可变剪接是在RNA水平调控基因表达的机制之一。
一个基因通过可变剪接产生多个转录异构体，各个不同的转录异构体编码结构和功能不同的蛋白质，它们分别在细胞/个体分化发育不同阶段，在不同的组织，有各自特异的表达和功能。因此，可变剪接是一种在转录后RNA水平调控基因表达的重要机制。
目前已知的可变剪接异构体中，只有一小部分明确确定了功能和生物学意义。第一个确定的可变剪接异构体功能是 IgM基因，其末端最后两个外显子的可变剪接，决定了所编码的膜型/分泌型IgM的产生。最著名的例子是果蝇性别决定系统，在此系统中，至少5个基因(sxl, tra, msl2, dsx, and fru) 转录体的可变剪接级联反应最终决定了果蝇雄性和雌性性别特征的表达。有些基因，可变剪接造成的蛋白质异构体之间功能上的差异没有被实验检测出来。不过阴性的结果不能代表没有功能差异，只是目前没有检测出来而已。也有很多异构体造成读码框架改变，不能被翻译为蛋白质，而是直接被降解了。真核生物也有mRNA监视系统NMD(nonsense－mediated degradation)，检测 mRNA中异常提前出现的终止密码子，一经发现，立即降解异常的mRNA，防止其翻译。在大多数情况下，检测可变剪接造成的蛋白质异构体之间功能上的差异的实验还没有开展。最近发展的RNAi技术，可以适应高通量的从功能基因组水平研究各基因可变剪接异构体的功能的要求。2000年已经有人将RNAi技术应用于模式生物线虫的可变剪接异构体的大规模研究上。（目前已经大量开始用于哺乳动物系统）
2.多样性与复杂性
可变剪接是从相对简单的基因组提高蛋白质组多样性的重要机制，蛋白质组的多样性与多细胞高等生物的复杂性相适应。从可变剪接涉及的基因分布格局分析，可变剪接多发生在参与信号传导和表达调节等复杂过程的基因上，如受体，信号传导通路（凋亡），转录因子等。对个体分化发育和一些关键的细胞生理过程如凋亡、细胞兴奋等的精确调控有重要意义。从可变剪接涉及的基因系统分类分析，可变剪接多发生在免疫和神经等复杂系统。正如Dscam 基因所示，可变剪接产生的多样性，赋予这些系统精确处理复杂信息相适应的潜力。
15. 说明生物体在长期进化过程中形成保证遗传稳定性的机制。（旧分子生物学讲义254页）
复制过程中错配修复机制；
DNA损伤修复机制；
基因的回复突变；
Codon degeneracy简并；
致死突变；
多倍体
16. 肽核酸是一种以肽为骨架的DNA类似物，是由手性不对称的中性肽骨架置换核糖磷酸骨架而成，试述其潜在的生物学意义。
肽核酸（PNA）是一种以中性酰胺键为骨架并兼有多肽和核酸性质的独特化合物，不能被蛋白酶和核酸酶所降解，可以高度亲和并序列特异地与DNA和RNA结合，而且形成的杂交复合物具有相当高的热稳定性以及独特的耐离子强度变化性质。PNA以链侵占方式与DNA 结合,抑制转录或提供人工强启动子促进转录; 与mRNA 结合,阻止蛋白质的合成; 还能导向核糖核蛋白的RNA部分,抑制其酶活性；它对端粒酶活性的抑制作用，大多数肿瘤细胞具端粒酶活性，端粒酶可作为肿瘤治疗中的一个有效靶位。总之，通过对转录和翻译的调节，可有效抑制癌基因的表达、病毒基因的复制和转录；可作为分子生物学工具、作为反义的和抗基因制剂，还可应用于诊断领域以及生物芯片和生物传感器方面。
17. 你试图在一中细胞系中敲除一基因，你可以用哪些方法。
T-DNA插入，物理化学诱变（tilling），然后筛选
RNAi
Anti-Sense RNA 抑制
同源重组cre/lox系统，GENE TARGETING
18. 如果你认为已经获得一个新基因，你说如何验证它。
遗传互补测验，RNAi/OVEREXPRESSION，体外表达，蛋白质的分离，和其它DNA/蛋白质的互作，MICROARRAY/DNA CHIP
19. 简述国际上转基因农作物的研究和产业化进展，以及有什么争议。何谓GMO？有人认为公众与新闻媒体的无知是引起GMO争议的主要原因之一，对此请予评论。
介绍：基因工程与传统育种相比的巨大优越性
原因：目前出现这个问题，有其复杂的社会因素和政治因素在里面。如果最简单地理解社会因素，第一就是这项技术带来的大规模利润不是被老百姓得到了。第二，普通群众的普遍想法是：既然价格都一样，我为什么还要冒这个险去吃它？万一有问题呢？这是最正常的心理，很简单。他们不能理解其中的生物学原理。第三，非政府组织，英文叫NGO，包括绿色和平组织和地球友好者组织，非常强大。第四是宗教问题，也很大。一些宗教认为，上帝已经创造了牿，而且很完善了，为什么还要改变？第五，就是媒体的炒做。
政治因素就更复杂了，这里有一个政治、经济和贸易的问题，已经不单纯是科学问题了。在科学界反对意见只占极少一部分，科学家需要用科学的语气来说服。
观点：第一，农业生物技术是解决未来的中国农业的重要手段，是解决未来食品短缺的重要技术，应当大力发展，不能因为某些缺乏科学根据的猜测而这个技术死掉这会伤害到整个世界农业的发展，尤其是食物短缺的发展中国家。不能因为一项猜测和怀疑就要求一切关于这项新技术的研究和实验都停止了。第二，新技术往往都是一把双刃剑；仅噎废食、简单绝对都不会给我们自己带来更多的好处。第三，关于科学和新技术的讨论还是有很大必要的。讨论也许可以让科学更透明、更公正，然后更能在人类能把握的尺度里来做。
展望：立法与科普，形成转基因产品研究、开发与销售一体化、网络化
20. 论叙FORWARD GENETICS 和REVERSE GENETICS进行基因遗传分析的方法和原理。
先介绍原理。常用技术和方法简介
REVERSE GENETICS（转座子标签法；RNA干涉；基因打靶）
21. 保证染色体稳定遗传的三个顺式作用位点是什么，说明它们的结构和功能。
DNA复制起点 自主复制序列（ARS），酵母基因组中含有200－400个ARS，大多数具有一个11bp富含AT的一致序列（ARS consenus sequence,ACS；确保染色体在细胞周期中能够自我复制，维持染色体在细胞世代传递中的连续性。
着丝粒 centromere DNA sequence CEN 由大量串联的重复序列组成，如α卫星DNA，其功能是使已完成复制的染色体能平均分配到子细胞中。
端粒 telomere 不同生物的TEL序列都很相似，由5－10bp的重复串联组成，人的重复序列是GGGTA。端粒对染色体的末端起一个封闭的作用，可以防止染色体DNA的降解。而且，如果没有端粒，染色体的游离末端之间就可能会发生融合，形成双着丝粒染色体，或分叉染色体，造成染色体断裂，基因重组，基因丢失等异常。另外，每复制一次减少50－100bp，与细胞衰老相关。
22. 何谓PARENT IMPRINT，说明这一现象的形成原因和生物学意义。
一定组织和细胞中，某些基因在DNA水平上的表达程度及表达时空受到一种后成修饰EPIGENETIC MODIFICATION机制控制，使仅来自双亲中某一亲本的基因得以表达，这一现象称为基因组印记。DNA甲基化，乙酰化，组蛋白修饰等等
表达调控
23. enhancer trap 、gene trap、 promoter trap
Reporter genes can be used to construct three basic types of gene trap: enhancer trap, promoter trap, and gene trap (Figure 1). Each type is able to respond to cis-acting regulatory sequences at the site of insertion. In an enhancer trap (Figure 1B), the reporter gene is fused to a minimal promoter, typically containing a TATA box and transcription start site, that is unable to drive reporter gene expression alone but can be activated by neighboring enhancer elements. Promoter traps and gene traps contain a promoterless reporter gene so that expression can occur only when the insertion is within a transcriptional unit and in the correct orientation (Figures 1C and 1D). Expression of a promoter trap reporter gene requires that it be inserted into an exon, leading to a transcriptional fusion (Figure 1C). In contrast, gene trap constructs contain one or more splice acceptor sequences preceding the reporter gene (Figure 1D), which allow expression if insertion occurs in an intron. Splicing from the splice donor sites in the chromosomal gene to the splice acceptor sites in the reporter gene results in fusion of upstream exon sequences to the reporter gene. In addition to transcriptional fusions, promoter trap and gene trap insertions can also create translational fusions, which may provide information about protein localization.
Each type of reporter gene construct has its own advantages. Because enhancer traps do not have the same constraints on expression as promoter and gene traps, which must insert within a gene and in the correct orientation, enhancer trap insertions lead to a higher frequency of reporter gene expression. However, expressed promoter or gene traps are more likely to cause gene disruption than are expressed enhancer traps. Also, because enhancers can activate gene expression at considerable distances, the genes controlling reporter gene expression may be more easily identified in promoter or gene trap insertions than in enhancer trap insertions.控制报告基因表达的基因的表达更容易得到检测。
24. 我认为可能考的题目：
tilling Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) for Plant Functional genomics
The strategy is illustrated in Figure 1. The steps are: (a) EMS mutagenesis (Redei and Koncz, 1992; Feldmann et al., 1994; Lightner and Caspar, 1998); (b) DNA preparation and pooling of individuals; (c) PCR amplification of a region of interest; (d) denaturation and annealing to allow formation of heteroduplexes; (e) DHPLC, where the presence of a heteroduplex in a pool is detected as an extra peak in the chromatogram; (f) identification of the mutant individual; and
(g) sequencing of the mutant PCR product.
在DNA部分变性的条件下，变异型和野生型的PCR产物不仅能形成同源双链，也能错配成异源双链。同源双链和异源双链溶解温度的差异使色谱固定相保留它们的能力有所不同。这样。根据柱上的保留时间可以分辨同源双链和异源双链，从而识别变异型。
real time-PCR
Real-time quantitative PCR 是指在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线来对未知模板进行定量分析的方法。借助荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面可以在每次PCR循环收集数据，建立实时扩增曲线，准确地确定域值循环数（CT值），计算起始拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。根据得到的数据不同，可分为相对定量和绝对定量两种。
Cycle threshold：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数春在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
常用荧光标记方法有：SYBER GREEN I,Taqman probe, FRET, Molecular Beacon
与传统的PCR技术相比，Real-time Q-PCR的不足之处是：（1）由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；（2）因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了real-time Q-PCR的复合式（multiplex）检测的应用能力；（3）目前real-time Q-PCR实验成本比较高，从而也限制了其广泛的应用
酵母双杂交
酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立 i 。典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用， 启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达， 其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad没有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中， 蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)， 从而可分析蛋白间的结合作用。酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用， 具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行， 而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强， 后者又与启动子DNA结合， 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。 同时， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
DNA shuffling
DNA shuffling is a method for in vitro recombination of homologous genes invented by W.P.C Stemmer (1). The genes to be recombined are randomly fragmented by DNaseI, and fragments of the desired size are purified from an agarose gel. These fragments are then reassembled using cycles of denaturation, annealing, and extension by a polymerase. Recombination occurs when fragments from different parents anneal at a region of high sequence identity. Following this reassembly reaction, PCR amplification with primers is used to generate full-length chimeras suitable for cloning into an expression vector. In several instances, chimeric enzymes with improved activity and stability have been isolated from libraries constructed using DNA shuffling. In other cases, the method resulted in libraries with either too many mutations or too few crossovers to be useful. The DNA shuffling method we describe in this chapter is a hybrid of various published methods that has yielded highly chimeric libraries (as many as 3.7 crossovers per 2.1 kb gene) with a low mutagenesis rate (8). |
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发表于 2006-7-30 19:16:40
CR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交.⑤显微镜观察结果.原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值.其特异性和敏感性高于一般的PCR.