奥曲肽对人卵巢癌细胞增殖影响

唐风

生长抑素(somatostatin,SST)是一种环状多肽类激素,由Brazeau等［1］于1973年从羊下丘脑中分离提取。现在认为SST对许多疾病如肿瘤、炎症、糖尿病、癫痫、早老性痴呆、帕金森病、亨廷顿舞蹈病以及艾滋病的发生、发展以及防治具有重要的意义［2］ 。奥曲肽(SMS-201995,OCT)为生长抑素8肽类似物,是第一个用于临床的生长抑素类似物，目前其主要用于肝癌、胃癌、胰腺癌的辅助治疗。目前国内外关于奥曲肽对卵巢癌作用的研究报道较少。本实验通过裸鼠移植瘤模型观察奥曲肽对卵巢癌细胞株SKOV3增殖的影响,并初探其作用机制。


  1 材料与方法


  1.1 材料 (1)基础培养液：RPMI 1640，加入10%小牛血清(杭州四季青生物公司)。(2)胰蛋白酶(上海华美公司)：溶于D-Hanks液中配制成0.25%浓度。(3)生长抑素类似物奥曲肽：由上海子能制药有限公司合成。(4)顺铂(Cisplatin):山东齐鲁制药厂产品， 4℃保存。(5)人卵巢癌细胞株SKOV3：购自第四军医大学西京医院妇产科实验室。细胞置于37℃,5%CO2培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化细胞成单细胞悬液。   (6)雌性BALB/c-nu/nu裸小鼠：购自中国医学科学院实验动物研究所，体重18～22g，SPF环境下饲养。(7)兔抗人血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体：购自北京中杉金桥生物技术有限公司。


  1.2 方法


  1.2.1 卵巢癌裸鼠移植瘤模型的建立 将SKOV3细胞制成单细胞悬液,以5×106个细胞/只，接种于裸鼠右侧腋窝靠近背部皮下，共接种20只。


  1.2.2 药物干预移植瘤 建模2周后将20只裸鼠随机分成4组,每组5只，4组分别为空白对照组、奥曲肽组、顺铂组、奥曲肽与顺铂联用组。空白对照组皮下注射生理盐水100μg/（kg·d），1次/d；奥曲肽组皮下注射奥曲肽100μg/（kg·d）, 1次/d；顺铂组分别于成瘤后第1、8、15、22日腹腔注射顺铂4mg/kg；奥曲肽与顺铂联用组皮下注射奥曲肽100μg/（kg·d）, 1次/d,并于成瘤后第1、8、15、22日腹腔注射顺铂4mg/kg。用药4周后颈椎脱位法处死裸鼠，皮下剥离瘤体，称取肿瘤重量，游标卡尺测量肿瘤长径（a）和短径（b），按公式V=ab2/2计算肿瘤体积。抑瘤率=(对照组瘤体积-实验组瘤体积) /对照组瘤体积×100%。肿瘤标本分为两份，一份置于10％中性缓冲福尔马林液中固定，常规脱水，透明，浸蜡，包埋，5μm连续切片。另一份立即制成单细胞悬液行流式细胞分析。


  1.2.3 流式细胞仪分析细胞周期 肿瘤组织采用机械法分离，制备成浓度为1×106/ml的单细胞悬液，70％乙醇固定，4℃保存，染色前用PBS洗去固定液，加200μl RNase A 37℃水浴30min,再加入800μl PI染色混匀，4℃避光30min,FACS Vantage SE型(B-D公司)流式细胞仪检测细胞周期，随机软件对观测值进行分析。


  1.2.4 病理分析及免疫组织化学法检测VEGF表达 肿瘤切片行常规苏木精-伊红染色，显微镜下观察肿瘤细胞形态。免疫组织化学染色采用二步法，结果判定以细胞浆呈清晰棕黄色为阳性，采用计算机图像分析软件Image－Pro plus 4.5对VEGF阳性部位进行原位定量检测，每张切片随机选取5个视野，自动选取阳性部位并计算平均光密度（IOD）值,计算5个视野的平均值作为该切片的代表值。


  1.2.5 统计学处理 结果以均数±标准差(x±s)表示,数据处理采用SPSS11.5统计软件进行，多组间比较采用方差分析,两两之间用q检验。P<0.05认为差异有显著性。


  2 结果


  2.1 奥曲肽对裸鼠卵巢癌移植瘤生长的影响  20只裸鼠接种7天后，于接种部位皮下均可见直径约2mm的瘤块，致瘤率为100%。用药满28天时20只裸鼠均存活。处死裸鼠，见肿瘤处皮肤表面无溃疡结痂，肿瘤包膜完整，均可用手推动。奥曲肽组、顺铂组、奥曲肽与顺铂联用组肿瘤重量及体积均明显低于对照组，差异有显著性。各用药组两两比较，肿瘤重量及体积差异无显著性。见表1。 表1 各用药组移植瘤重量及体积的变化注：*F=4.007，P=0.026；○P=0.938；** F=6.771，P=0.004；△P=0.509


  2.2 奥曲肽对肿瘤细胞周期的影响 各用药组与对照组相比S期及G2/M期肿瘤细胞百分比增加，但差异均无显著性。见表2。 表2 各用药组移植瘤细胞周期分布注：*F=1.710，P=0.222； **F=1.443，P=0.283； *** F=4.041，P=0.051


  2.3 病理分析及免疫组织化学法检测VEGF表达 肿瘤组织苏木精-伊红染色切片见肿瘤细胞大小不一，胞浆粉红色，核圆形，肿瘤内可见血管结构。VEGF染色主要定位于肿瘤细胞胞浆,呈棕黄色,少数血管内皮细胞也见有阳性表达。各用药组移植瘤组织中VEGF表达明显下降，与对照组相比差异均有显著性（P<0.05）。但各用药组两两间比较差异无显著性。见表3，图1。表3 各用药组移植瘤内血管内皮生长因子（VEGF）的表达注：*F=32.68，P<0.001；○P=0.267


  3 讨论


  SST是一种首先从绵羊下丘脑中分离出来的环状多肽类激素，广泛分布于大多数人体器官组织，具有抑制激素分泌、调节神经传递及细胞增殖的作用。近年来, SST及其类似物(SSTA)对肿瘤细胞的抑制作用已越来越引起人们的关注,大量证据表明,SSTA不仅能抑制绝大多数具有神经内分泌功能肿瘤的增殖,而且对普通的实体瘤也具有生长抑制作用。已有研究证实卵巢癌中存在生长抑素受体（SSTR）的表达，如陈怀增教授等［3］采用RT-PCR 方法证实卵巢癌细胞株SKOV3及3AO均表达Ⅱ型生长抑素受体（SSTR2）。Hall等［4］利用免疫组化学方法对63例恶性卵巢肿瘤和35例良性卵巢肿瘤的SSTR表达进行了检测,发现SSTR在肿瘤组织上皮、间质以及血管中均有不同程度的表达,在卵巢肿瘤组织血管壁的中膜平滑肌中亦可见SSTR的高表达。这些实验提供了SST治疗卵巢癌的可能性。


  本实验结果显示在给予奥曲肽、顺铂及两药联合应用后，移植瘤重量及体积均明显低于对照组，但两两间抑瘤作用差异无显著性，提示对于卵巢癌，非化疗药奥曲肽可能具有相当于顺铂的抗肿瘤效果。顺铂是目前临床治疗卵巢癌病人的一线化疗药物，但其毒副反应较大且易产生耐药，而肽类化合物奥曲肽副反应小，可望用于对顺铂耐药的卵巢癌患者。


  肿瘤的血管生成是由肿瘤细胞分泌的各种促血管生成因子所诱发，其中VEGF是迄今为止发现的最重要的血管生成因子。它具有增加血管通透性、促进不同来源的内皮细胞分裂增殖和血管构建及促使内皮细胞迁移等多种作用,以VEGF作为抗肿瘤血管生成治疗的理想靶点已逐渐成为国内外学者的共识。Osada等［5］的研究表明VEGF高表达的卵巢癌患者生存率明显低于VEGF低表达者。本实验采用免疫组织化学染色法检测肿瘤组织内VEGF的表达，结果显示各用药组VEGF的表达较对照组明显下降，提示奥曲肽抗肿瘤作用机制之一为抑制肿瘤新生血管生成。


  据文献报道SST及SSTA抗肿瘤作用的机制可能包括：（1）通过与生长抑素受体（SSTR）结合直接抑制肿瘤细胞增殖。（2）抑制促肿瘤生长的激素或细胞因子的释放。（3）抑制肿瘤血管生成。（4）诱导肿瘤细胞凋亡［6～10］。本实验证实肿瘤VEGF表达的抑制可能为奥曲肽抑瘤机制之一，但其对肿瘤细胞周期的影响尚不确定。


  本实验证实奥曲肽对卵巢癌细胞株的抑制作用与传统抗肿瘤药顺铂相当，可为卵巢癌治疗提供新途径。但本实验仅围绕奥曲肽对卵巢癌细胞周期及VEGF表达的影响进行研究，而奥曲肽抑瘤机制广泛，尚需进一步实验研究来揭示其作用机制；并且实验中奥曲肽与顺铂合用时并没有增加抗增殖效果，奥曲肽用于联合化疗的方案尚待进一步确定。