cDNA差减杂交

yujian623

试剂清单
–70℃保存RNA，4×Hybridization buffer室温保存，其它试剂–20℃保存。
这个试剂盒包括足够7条cDNA合成的试剂。For best results, 每个反应用2礸的poly A+RNA；如果poly A+RNA用量不够的话，低量转录物的cDNA有可能在差减过程中丢失。这7个cDNA合成物可以作6次完整的差减实验以及一个对照，假设每次合成的cDNA在不同的实验（用来识别在特殊系统中上调和下调表达的cDNA）中都用作tester和driver的话。提供了足够的PCR试剂用于50个初级和100个次级PCR反应。具体的接头和引物序列见附录B。
第一链的合成
•  7祃  AMV 反转录酶(20U/祃)
• 10祃  cDNA Synthesis Primer (10 礛)
• 200 祃  5×First-Strand Buffer
250 mM  Tris-HCl (pH 8.5)
40 mM  MgCl2
150 mM  KCl
5 mM  Dithiothreitol

第二链的合成
• 28祃  20×Second-Strand Enzyme Cocktail
DNA polymerase I, 6U/祃
RNase H, 0.25U/祃
E. coli DNA ligase, 1.2U/祃
• 200 祃  5×Second-Strand Buffer
500mM  KCl
50mM  Ammonium sulfate
25mM  MgCl2
0.75mM  β-NAD
100mM  Tris-HCl (pH 7.5)
0.25mg/ml BSA
• 14祃  T4 DNA Polymerase (3U/祃)

核酸内切酶酶切反应
• 300 祃  10×Rsa I Restriction Buffer
100 mM  Bis Tris Propane-HCl (pH 7.0)
100 mM  MgCl2
1 mM  DTT
• 12祃  Rsa I (10U/祃)

连接头连接反应
• 21祃  T4 DNA Ligase (400 U/祃; contains 3 mM ATP)
• 200 祃  5×DNA Ligation Buffer
250 mM Tris-HCl (pH 7.8)
50 mM MgCl2
10 mM DTT
0.25 mg/ml BSA
• 30祃  Adaptor 1 (10 礛)
• 30祃  Adaptor 2R (10 礛)

杂交
• 200 祃 4×Hybridization Buffer
• 1.4 ml Dilution buffer (pH 8.3)
20 mM  HEPES (pH 6.6)
20 mM  NaCl
0.2 mM  EDTA (pH 8.0)

PCR扩增反应
•  50祃  PCR Primer 1 (10 礛)
• 100祃  Nested PCR primer 1 (10 礛)
• 100祃  Nested PCR primer 2R (10 礛)
•  10祃  PCR Control Subtracted cDNA

对照试剂
•  5祃  Control Poly A+RNA (1 礸/祃; from human skeletal muscle)
•  5祃  Control DNA (3 ng/祃)
(Hae III-digested bacteriophage FX174 DNA)
•  50祃  G3PDH 5' Primer (10 礛)*
•  50祃  G3PDH 3' Primer (10 礛)*
* These primers will amplify human, mouse, and rat species G3PDH genes.

常规试剂
•  20祃  dNTP Mix (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
• 100祃  20×EDTA/Glycogen Mix (0.2 M EDTA; 1 mg/ml glycogen)
• 400祃  NH4OAc (4 M)
•  1ml  sterile H2O

所需其它材料
还需要下列试剂盒中未提供的试剂。
• Hae III digest of bacteriophage ΦX174
我们推荐使用New England Biolabs DNA size markers (Cat. Nos.N3026S & N3026L).
• 0.5-ml PCR reaction tubes
我们推荐Perkin-Elmer GeneAmp 0.5-ml reaction tubes (#N801-0737 or N801-0180).
• 80%乙醇& 96%乙醇
• 苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)
• 氯仿：异戊醇(24:1)
• 50×PCR enzyme mix
  我们推荐我们自己的BD AdvantageTM cDNA Polymerase Mix(Cat. No. 639105; also provided in BD Advantage cDNA PCR Kits[Cat. Nos. 639101 & 639102]).这个操作步骤适用于这个用于长的cDNA的准确PCR扩增的Mix（Barnes, 1994; Cheng et al., 1994）。这个50×mix包含KlenTaq-1 DNA聚合酶 (an exo-minus, N-terminal deletion of Taq DNA polymerase), a proofreading polymerase, and TaqStartTM Antibody for automatic hot start(Kellogg et al., 1994). 另外，只用Taq DNA聚合酶也可以，但是在初级和次级PCR反应中需要额外的3-5个循环。注意这些循环可能会增加提高背景，减小你的差减文库中差异表达克隆的百分比。
注意：如果你不使用BD Advantage cDNA Polymerase Mix, 我们强烈推荐使用BD TaqStart Antibody (Cat. Nos. 639250 & 639251), 手动热启，或者使用蜡珠热启来降低非特异性DNA扩增的水平。
• 10×PCR buffer
使用与你的DNA polymerase或mix (包含BD Advantage cDNA Polymerase Mix [Cat. No. 639105]和BD Advantage cDNA PCR试剂盒[Cat. Nos. 639101 & 639102])配套提供的10×reaction buffer.
• dNTP Mix for PCR (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
• 50×TAE电泳缓冲液
242 g  Tris base
57.1 ml  Glacial acetic acid
37.2 g  Na2EDTA•2H2O
Add H2O to 1 L. For 1×TAE buffer, dilute 50×stock solution 1:49 with H2O.

BD PCR-Select cDNA Subtraction Protocals
开始实验前请仔细阅读整个操作手册。
A．  常规考虑
  戴手套以防止RNA和DNA样品被核酸酶降解。
  此操作手册中的循环参数最适合于Perkin-Elmer DNA PCR仪 480和Perkin-Elmer GeneAmp Systems 2400/9600。合适的参数应根据不同的热循环，聚合酶混合液和模板有所改变。
  如果你在Northern杂交之前使用BD PCR-Select差显试剂盒(Cat. No. 637403)筛选样品，你需要做两次差减：初步差减（前差减）和反向差减（其中tester用作driver，而driver用作tester）。需了解更多有关差显的更多信息，参见Section 4和BD PCR-Select差显试剂盒用户手册（PT3831-1）。
  开始PCR时必须使用热启以降低非特异性DNA的合成。我们推荐使用TaqStart Antibody(Kellogg et al., 1994)或者手动热启(D’aquila et al., 1991)。这个操作步骤最适合用于我们的BD TaqStartTM Antibody (individually available as Cat. Nos. 639250 & 639251; also included in our BD AdvantageTM cDNA Polymerase Mix [Cat. No. 639105]).
  To resuspend pellets and mix reactions，用枪轻柔上下吸打，离心机甩一下使在管底。
  Mix phenol:chloroform extractions by vortexing.
  最后将酶加到反应混合物中，轻轻上下吸打反应混合液使完全混匀。
  不要增加反应中酶的用量或DNA的浓度，因为这些是经过精心优化的。
  尽管不是必需的，我们仍推荐您在第一链的合成反应中加入[α-32P]dCTP以帮助衡量cDNA的产量，确定DNA沉淀的效率以及方便cDNA合成中的故障检修。
B． RNA的准备和处理
1．常规预防措施
完整的、纯的poly A+RNA对于高质量cDNA的合成的非常关键的。为避免RNA污染和降解，同时使RNases出现的可能性最小，进行下列预防措施：戴手套防止手上的RNases污染，使用洁净的枪头分装小体积（或者任意灭菌移液管用于较大体积的取用）。
2．RNA分离
参见Farrell et al., 1993或Sambrook et al., 2001的程序。无论何时只要可能，用于比较的总RNA样品应用相同的试剂和步骤一起纯化。这个操作可以减少假阳性的可能性。
3．RNA分析
分离总RNA和poly A+ RNA之后，在含甲醛的1%琼脂糖/EB变性胶电泳检测RNA的完整性。完整的哺乳动物总RNA呈典型的2条亮带-核糖体28S和18S RNA-分别约为4.5和1.8kb，强度比例约为1.5-2.5：1。哺乳动物poly A+ RNA表现为0.5-12kb的smear带有弱的核糖RNA。其大小可能小于非哺乳类的0.5-3kb。
如果你实验用RNA琼脂糖电泳表现得比期望小（如：不到1-2kb），呈小于1-2kb的smear，并/或28S和18S的强度比小于1：1，你的RNA必定不纯或已降解。我们建议你检测所有的RNA抽提试剂是否存在RNase或者其他杂质。质量差或降解的RNA在差减操作中会产生很高的背景而不能用于实验。
C． cDNA第一链的合成
每个用于实验的tester和driver poly A+ RNA以及试剂盒中提供的对照Poly A+ RNA（来自人类骨骼肌）。骨骼肌的cDNA在此部分后面的步骤中是作为对照driver cDNA使用的。在F部分中，加入少量的对照DNA（Hae III消化的ΦX174）到部分骨骼肌双链cDNA中作为模拟tester cDNA。然后你应该用这些在相应的差减实验中的骨骼肌tester和driver cDNA作一个完整的对照差减实验。对照差减实验帮助你估计双链cDNA的产量和大小分布。
1.  对每个tester, driver和对照Poly A+ RNA（来自人类骨骼肌），在0.5ml的灭菌离心管（不要使用聚苯乙烯管）中混合下列成分。
              per rxn
   poly A+ RNA(2μg)        2-4μl*
  cDNA 合成引物（10μM）      1
*对于对照的合成，加入2μl骨骼肌对照poly A+ RNA。
如果有必要，加入灭菌水使终体积5μl。混匀，离心机甩一下。
2.  在PCR仪中70℃温育2min。
3.  置冰上2min，离心机甩一下。
4.  每个反应中加入下列成分：       per rxn
5×First-Strand Buffer       2μl
  dNTP Mix (10 mM each)      1μl
  灭菌水*           1μl
  AMV 反转录酶(20U/祃)      1μl
*如需监控cDNA合成的进程，加9μl水稀释1μl [α-32P]dCTP(10mCi/ml, 3000Ci/mmol)，取1μl该稀释标记代替上述成分中的水。
5.  离心机轻甩一下。
6.  干浴中42℃温育1.5hr。
注意：不要使用水浴或PCR仪。蒸发会减少反应混合物的体积，因此，反应效率。
7.  置冰上终止cDNA第一链的合成，并立即执行Section D的操作。
D． cDNA第二链的合成
对每个第一链tester, driver和对照骨骼肌cDNA执行下列操作。
1．  在合成第一链反应的管（已含10μl）中加入下列成分：  per rxn
灭菌水               48.4μl
5×Second-Strand Buffer          16.0μl
dNTP Mix (10 mM )           1.6μl
20×Second-Strand Enzyme Cocktail       4.0μl
2．  混匀，离心机甩一下。终体积应为80μl。
3．  水浴或PCR仪中16℃温育2hr。
4．  加入2μl(6U)的T4 DNA合成酶，混匀。
5．  水浴或PCR仪中16℃温育30min。
6．  加入4μl 20×EDTA/Glycogen Mix终止第二链的合成。
7．  加入100μl苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)。
8．  充分混匀，室温14000rpm离心10min，使分层。
9．  小心吸取上清于一新的0.5ml离心管中。中层和下层液相丢弃，但要适当处理。
10．  加入100μl氯仿：异戊醇(24:1)。
11．  重复步骤8和9。
12．  加入40μl 4M NH4OAc和300μl 95%乙醇。
注意:立即处理沉淀。不要将管子置-20℃，长时间处这个温度会沉淀不需要的盐类。
13．  充分混匀，室温14000rpm离心20min。
14．  小心收集上清。[如果用[α-32P]dCTP标记了，用改革计数器检查沉淀信号。]
15．  加入500μl 80%的乙醇。
16．  14000rpm离心10min。
17．  弃上清。[如果用[α-32P]dCTP标记了，用改革计数器检查沉淀信号。]
18．  空气中晾10min，使剩下的乙醇挥发。
19．  50μl灭菌水溶解沉淀。
20．  转移。。。
E． Rsa I 酶切
对每个实验用双链tester和driver以及对照骨骼肌cDNA进行下列操作。这一步产生短的平端的双链cDNA片段用于差减实验以及Section F中的加接头。
1.  加入下列试剂：        per rxn
双链cDNA        43.5祃
10×Rsa I Restriction Buffer    5.0祃
Rsa I (10U/祃)       1.5祃
2.  混匀，离心机甩一下。
3.  37℃温育1.5hr。
4.  取出5祃酶切反应液分析Rsa I酶切效率，如Section Ⅴ.B中所述。
5.  加入2.5祃 20×EDTA/Glycogen Mix终止反应。
6.  加入50μl苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)。
7.  充分混匀，室温14000rpm离心10min，使分层。
8.  小心吸取上清于一新的0.5ml离心管中。
9.  加入50μl氯仿：异戊醇(24:1)。
10.  重复步骤7和8。
11.  加入25μl 4M NH4OAc和187.5μl 95%乙醇。
注意:立即处理沉淀。不要将管子置-20℃，长时间处这个温度会沉淀不需要的盐类。
12.  重复步骤7。
13.  弃上清。
14.  加入200μl 80%的乙醇。
15.  14000rpm离心5min。
16.  小心弃上清。[如果用[α-32P]dCTP标记了，用改革计数器检查沉淀信号。]
17.  空气中晾5-10min。
18.  5.5μl灭菌水溶解沉淀，-20℃保存。
19.  琼脂糖/EB凝胶电泳检测经Rsa I酶切的cDNA。
F． 加接头的连接反应
接头不能连接在driver cDNA上。
1．  用5μl灭菌水稀释Rsa I 酶切后的实验用cDNA。
如果是用BD Super BD SMART PCR cDNA Synthesis Kit制备的cDNA，使用Super SMART步骤中用Rsa I 酶切后纯化的cDNA。
2．  准备对照骨骼肌tester cDNA：
a  将φX174/Hae III Control DNA稀释至150ng/ml。
b  将1祃 control skeletal muscle cDNA与5μl稀释后的φX174/Hae III Control DNA混合。
这就是你的control skeletal muscle cDNA。包含0.2% Hae III酶切的φX174 DNA；每个片段约对应0.02%的总cDNA。骨骼肌tester cDNA和骨骼肌driver cDNA扣除杂交之后，the primary bands produced in the final PCR should correspond to these control fragments. 如果是用BD Super BD SMART PCR cDNA Synthesis Kit制备的cDNA，应该在Super SMART步骤后用人类胎盘cDNA重复步骤2。之后的步骤中，应将人类胎盘cDNA作对照与骨骼肌cDNA作对照一起分析。
Tester cDNA加接头：
3．  将以下试剂配制成连接Master Mix装在0.5ml离心管中，可多配一份反应的体积以保证Master Mix足够。          per rxn
灭菌水          3μl
5×连接缓冲液         2μl
T4 DNA连接酶（400U/μl）     1μl
注意：连接反应所需的ATP是连接反应体系的成分（初始浓度3mM，终浓度是300μM）。
4．  将实验tester cDNA与作对照的骨骼肌tester cDNA，分别于表中所示的试剂混合，装在0.5ml离心管中，上下颠倒混匀。
表一：连接反应的建立（适用于每个实验用tester cDNA和对照骨骼肌tester cDNA）
管子编号
1  2
成分  Tester1-1*  Tester1-2*
稀释的cDNA  2μl  2μl
接头1(10μM)  2μl  -
接头2R(10μM)  -  2μl
Master Mix  6μl  6μl
终体积  10μl  10μl
*对Tester2-1和2-2，3-1和3-2使用相同的体系。
5．  在一个新的离心管中，将2μl Tester1-1和2μl Tester1-2混合。连接反应完成后，这将是无差异显示的tester对照1-c（见图3）。将其它的实验用tester cDNA和对照骨骼肌tester cDNA。连接反应后，约1/3的无差异显示的tester对照cDNA分子带有两个不同的接头。
6．  离心机甩一下，16℃温育过夜。
7．  加1祃 EDTA/Glycogen Mix终止连接反应。
8．  72℃加热5min，使连接酶失活。
9．  离心机甩一下。至此，加接头的反应全部完成。
10．  从无差异显示的tester对照（1-c, 2-c, 3-c）中各取1祃，稀释至1ml。用这些样品来做PCR（Section Ⅳ.I）。
11．  -20℃保存样品。
在作Section Ⅳ.G之前，应先按照Section Ⅴ.C描述的作连接效率分析。

G． 第一次杂交
在作以下介绍前，应先分析连接效率（Section Ⅴ.C）。如果连接效率低，重新作连接反应。
在下面的步骤中，过量的driver cDNA加到每管tester cDNA中，样品先加热变性，然后退火，剩下的ss cDNA（适于作第二次杂交）大量扩增，它们是差异表达的序列，因为非目标的cDNA已相互杂交。
重要：进行杂交前，应将4×杂交缓冲液在室温下放置至少15-20分钟。使用前确保无可见的沉淀，如有必要，37℃加热10min左右。
1.  对于每份实验tester和骨骼肌tester处理样品，在0.5ml离心管中按表二的顺序加入以下试剂。
表二：第一次杂交体系的建立（适用于每个实验用tester cDNA和对照骨骼肌tester cDNA）
杂交样品
1  2
成分  Tester1-1*  Tester1-2*
Rsa I酶切的driver cDNA(Ⅳ.E.21)  1.5μl  1.5μl
接头1连接后的Tester1-1*(Ⅳ.F.9)  1.5μl  -
接头2R连接后的Tester1-2* (Ⅳ.F.9)  -  1.5μl
4×杂交缓冲液  1.0μl  1.0μl
终体积  4.0μl  4.0μl
*对Tester2-1和2-2，3-1和3-2使用相同的体系。
2.  矿物油覆盖，稍离心。
3.  PCR仪上98℃处理1.5min。
4.  68℃温育8hr*。
*杂交应在6-12hr内完成，不能超过12hr。

H． 第二次杂交
第一次杂交的两份样品混合，加入刚变性的driver cDNA，进一步扩增差异表达的序列。新杂交的分子是由两端带有不同接头的差异表达的cDNA形成的。
重要：第一次杂交的样品在这步不需要变性。同样，在加入新的driver时，尽可能的少将样品拿离PCR仪。
每个实验tester cDNA和对照都按以下步骤处理。
1.  在灭菌管中加入以下试剂：       per rxn
Driver cDNA(Step Ⅳ.E.21)      1祃
4×杂交缓冲液           1祃
灭菌水             2祃
2.  取1祃此混合液加入一个0.5ml离心管中，滴加矿物油覆盖。
3.  在PCR仪上98℃加热1.5min。
4.  将刚变性的driver从PCR仪中拿出，按以下步骤同时将样品1和2分别与diver混合杂交（Section Ⅳ.G制备，见表二）。这步保证只有当刚变性的driver存在时才能将两个杂交样品混合。
a.  将移液枪设定在15祃。
b.  小心将枪头伸入样品2离心管中矿物油液面下。
c.  小心将样品2全部吸入枪头中，如果混有少量矿物油不要紧。
d.  将枪头移出离心管，吸入少量空气，使样品液滴下有一段空气。
e.  重复b-d吸入刚变性的driver。则枪头中含有样品2和变性的driver中间由空气阻隔。
f.  将所有混合液移入样品1。
g.  上下吸打混匀。
5.  如有必要稍离心。
6.  68℃反应过夜。
7.  加200祃 buffer稀释液，用枪混匀。
8.  PCR仪上68℃加热7min。
9.  -20℃保存。

I．  PCR扩增
差异表达的cDNA将在这节描述的两步反应中选择性扩增，在扩增前，没有连接的接头加入，在75℃停留片刻（Step Ⅳ.I.6）；这就是PCR反应的引物1（见图2）。在第一次扩增时，只有两头连接了不同接头的序列才能大量扩增。第二次扩增时，巢式PCR进一步降低背景并扩增差异表达序列。
图3描述了7小步PCR反应：（1）正向扣除实验cDNA，（2）未扣除的tester对照(1-c)，（3）反向扣除实验cDNA，（4）反向扣除作对照的未扣除的tester对照(2-c)，（5）扣除的对照骨骼肌cDNA，（6）扣除对照作对照的未扣除tester(3-c)，（7）扣除的cDNA PCR对照。扣除cDNA的PCR对照并含有扣除的混合物（含Hae III酶切的FX174 DNA）。建议作一个标准的PCR对照（即在BD Advantage cDNA PCR试剂盒中约阳性对照模板）来确认酶的效率特别高。
注意：
  所有循环参数最适合于Perkin-Elmer DNA PCR仪480和Perkin-Elmer GeneAmp Systems 2400/9600。其他PCR仪的循环参数仍需摸索优化。
  如果不是使用的BD Advantage cDNA Polymerase Mix, 也可以使用Taq DNA聚合酶，只是在第一次和第二次PCR中需要增加3-5个循环，也必须使用热启动(Section Ⅳ.A)。使用BD TaqStart Antibody (Cat. Nos. 639250 & 639251; also included in the BD cDNA Polymerase Advantage Mix [Cat. No. 639105])效果最好。但你也可以如下作热启动：(1)准备第一次PCR Master Mix但不加Taq聚合酶。(2)混合样品75℃加热1min。(3)迅速加入足够量的Taq聚合酶。(4) 75℃放置2min。(5)如下述步骤8进行PCR反应。
1.  准备PCR模板：
a.  各取1祃稀释好的cDNA (即Step Ⅳ.H.9中的每个经扣除的样品和Step Ⅳ.F.10相应的稀释好的未经扣除的tester对照)加入写有相应记号的管中。
b.  各取1祃 PCR对照的扣除的cDNA，加到写有相应记号的管中。
2.  准备第一次PCR反应的Master Mix，多配一管，按表三的顺序配制：
表三：第一次PCR Master Mix的准备
试剂  每管体积  7管所需体积*
灭菌水  19.5祃  156.0祃
10×PCR反应液  2.5祃  20.0祃
dNTP Mix(10mM)  0.5祃  4.0祃
PCR引物1(10礛)  1.0祃  8.0祃
50×BD Advantage cDNA Polymerase Mix  0.5祃  4.0祃
总体积  24.0祃  192.0祃
*对额外的实验cDNA，准备额外的Master Mix。
3.  混匀，稍离心。
4.  向步骤1中准备的模板中加24祃 Master Mix。
5.  加50祃矿物油覆盖。
6.  在PCR仪中75℃加热反应物5min以延伸接头（不要将样品从PCR仪中取出）。
注意：这一步“填补”接头的缺失链（见图2），为PCR引物创造结合位点。
7.  立即进行PCR反应：

Perkin-Elmer DNA PCR仪：
27个循环：
  94℃  30sec
  66℃  30sec
  72℃  1.5min
  
Perkin-Elmer GeneAmp Systems 2400/9600：
  94℃  25sec
27个循环：
  94℃  10sec
  66℃  30sec
  72℃  1.5min

8.  每管取8挡?铮?