白细胞移动抑制试验技术

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一、基本原理

当抗原刺激机体时，机体可同时产生体液免疫反应和细胞免疫反应。在效应性T淋巴细胞接受抗原时，就进一步分化增殖形成致敏的淋巴细胞，使机体处于致敏状态。当机体再次接受同样抗原时，致敏的T淋巴细胞一方面直接表现出杀伤靶抗原的作用；另一方面则释放出各种淋巴因子，其中主要包括各种白细胞介素和淋巴因子，去调动或激活各种免疫细胞以及相关的非免疫细胞，达到清除靶抗原的目的。在淋巴因子中，对同一细胞就有多种淋巴因子相互作用，如对巨噬细胞和粒细胞，就有吸引因子、激活因子和游走抑制因子等多种淋巴因子在起作用。
本试验就是在某一抗原致敏的淋巴细胞中，再次加入同种抗原，刺激淋巴细胞产生巨噬细胞游走抑制因子（MMIF）和白细胞游走抑制因子（LMIF），结果导致这些细胞的游走抑制。

二、材料及试剂

1．抗原 根据实验者的目的不同而选定。将抗原以细胞培养液稀释至一定浓度使用。
2．致敏动物或被检动物 如注射卡介苗的动物或被检结核的动物，则上述抗原就用结核杆菌精制蛋白衍生物（PPD）。
3．细胞培养液 一般用于细胞培养的营养液均可，如199、1640，含10％～20％犊牛血清的乳化液等。
4．毛细玻璃管 内径0.6mm～1.0mm，两端粗细一致，长度7cm～8cm。用于同一批试验材料的毛细玻璃管的内径最好一致，否则，结果误差大。
5．平底凹孔玻璃板 凹孔直径2cm左右。也可用小玻璃碟或链霉素小瓶替代。将链霉素小瓶切断，留底部高1cm左右，将切口部磨平即可。
6．水平转子离心机、蜡烛、砂轮片、小镊子、真空干燥器、石蜡等。

三、操作方法

1．由致敏动物或被检动物无菌操作采血10ml左右，放入灭菌试管中，肝素抗凝。自然沉降，分离血浆。吸取血浆，等量加入数只小试管中。
2．每管加入5ml Hank’s液，1 500r/min离心10min，弃上清，重复洗涤两次，弃上清。
3．于试管中加入含有相应抗原的营养液5ml，对照管中则只加营养液5ml，不含相应抗原。混匀，37℃温育1h。
4．将试验组和对照组的试管离心，弃上清液，剩下的细胞约0.3ml，混匀。
5．将试管倾斜，插入毛细玻璃管，利用虹吸作用将细胞液吸入毛细管中，约65mm处，停止虹吸。同一试验组和对照组各做毛细管4～5支，并力求高度一致。做好标记。
6．用熔化的石蜡将毛细管封闭，然后倒过来封端在下，装入小试管中，2 000r/min离心5min，使细胞沉积于封固端。
7．用砂轮片将毛细管在细胞层与上清液交界处稍靠细胞层一侧划痕折断，细胞层约6mm～10mm。然后用灭菌的凡士林将毛细管粘在凹孔玻璃板中或特制小碟中，开口向中央，同一材料的毛细管为一组，开口相对。将凹孔玻板中倒满营养液，没过毛细管，加盖片封闭。
8．放入玻璃干燥器中，点燃蜡烛，盖严干燥器，待蜡烛熄灭后将干燥器置37℃温箱培养18h～24h，取出观察结果。

四、结果判定

1．显微镜判定 取出小皿置载物台上，用低倍镜观察。加有抗原的组与被致敏的动物白细胞的毛细管的细胞移出的面积小，或不移行出，未加抗原的对照组，则细胞移出的面积大，两者差异明显。然后观察待测动物组，如已被致敏或感染过该抗原相对的疾病，则表现出移动受到抑制，否则细胞移动和对照组一样，未受到抑制。
2．移动指数（MI） 可用求积仪求出面积，或以显微扫描仪将白细胞移动区的半圆形图像描绘在白纸上，剪下图像，称重。按下列公式计算移动指数：

MI值在1左右，表示该抗原对白细胞无明显的抑制作用。如MI显著小于1，则表示该抗原对白细胞有明显的抑制作用，也即表示机体对该抗原有明显的细胞免疫反应。

五、注意事项

1．采血、离心过程和培养等均需无菌操作，无菌是本试验成功的关键。
2．毛细管管内径的大小一致是本试验准确性的一个重要因素。
3．移出的细胞主要是多形核白细胞和单核细胞。多形核细胞移行的最远，靠近毛细管的主要是单核细胞。而淋巴细胞则很少移出。
4．抗原也可以直接加入凹孔玻璃板的营养液内而一起孵育。