正交法测定几种因素对酶活力的影响

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一、实验目的
1．初步掌握正交法(正交试验设计法)的使用。
2．运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度和pH 值这四种因素对酶活力的影响。

二、实验原理
酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、温度、抑制剂和激活剂等都能影响酶催化的反应速度。通常在其他因素恒定的条件下，通过某一因素在一系列变化条件下的酶活力测定求得该因素的影响，这是单因素的试验方法。对于多因素的试验可以通过正交试验设计法(简称正交法)来完成。正交法是借助于正交表，简化表格计算，正确分析结果．找到实验的最佳条件、分清因素的主次，这样就可以通过比较少的实验次数达到好的实验效果。
本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度、pH 值这四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和pH 值时酶的活力最大。

三、仪器、原料和试剂
仪器
试管及试管架、恒温水浴箱、小漏斗及滤纸、分光光度计、吸量管、小漏斗及滤纸、 pH 计。
原料
牛血清白蛋白、牛胰蛋白药。
试剂
1. 牛血清白蛋白：20mL 蒸馏水中加入牛血清白蛋白2.2g，尿素36g，1mol/LNaOH 溶液8mL，室温放置1h，使蛋白质变性。如有不溶物，可过滤除去。再加0.2 mol/LNaH2PO4溶液至110mL 及尿素4g，调节溶液pH 达7.6左右。
2. 蛋白酶液：3mg 牛胰蛋白酶冷冻干粉，溶于10mL 蒸馏水。
3. 15％三氯乙酸溶液：15g 三氯乙酸溶于蒸馏水．并稀释至100mL。
4. lmol/LpH 7、8、9巴比妥缓冲液
5. Fo1in-酚甲试剂
① 4％碳酸钠溶液； ②0．2％氢氧化钠溶液；
③1％硫酸铜溶液； ④2％酒石酸钾钠溶液
临用前将①与②等体积配制碳酸钠氢氧化钠溶液。②与④等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后把这两种试剂按50：1的比例混匀。即成Folin—酚甲试剂。此试剂临用而配制，一天内有效。
6. Folin—酚乙试剂
向2L 容积的磨口回流瓶中加入100g 钨酸纳(NaWO4·2H2O)，25g 钼酸钠(NaMoO4H2O)及700mL蒸馏水，再加人85％磷酸50mL 及浓盐酸100mL，充分混和后，接上回流冷凝管，以小火回流10h(烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防止溶液沸溢)。回流结束后再加入150g 硫酸锂(Li2SO4)，50mL 蒸馏水及液溴数滴，然后开口继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后溶液呈鲜黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加溴水的步骤)，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，即成Folin—酚乙试剂，滤掖置于棕色试剂瓶中，可在冰箱内长期保存。若此储存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，恢复原色仍能继续使用。
Folin—酚乙试剂储存液在使用前使酸度最终为1moL／L。可用标准NaOH 溶液(1mol/L 左右)，以酚酞作指示剂，当溶液颜色由红一紫色一紫－灰墨绿时即为滴定终点。该试剂储存液的酸度应为2moL/L 右，将之稀释至相当于1moL/L，酸度便可使用。
7. 0.1mol/LNaH 2PO4溶液
8. 尿素
9. 1mol/LNaOH 溶液
四、操作步骤
(一)实验设计
1.确定试验因素和水平
本实验取四个因素，即底物浓度[S]、酶浓度[E]、温度、pH 值。每个因素选三个水平(水平即在因素的允许变化范围内，要进行试验的”点”)。试验因素和选用水平如下表所示。
作因素、水平表时，各因素的水平最好不要按大小顺序排列。

按一般方法，如对四个因素三个水平的各种搭配都要考虑，共需做34×81次试验，而用正交表只需做9次试验。

2.选择合适的正交表

合适的正交表，是指要考察的因素的自由度总和，应该不大于所选正交表的总自由度。

正交表Ln(tq)

L—正交表的代号；n—处理数(试验次数)；t —水平数；q—因素数。
各管均加人15％三氯乙酸溶液2mL 终止反应。另取试管一支作非酶对照，即加2％血红蛋白液0.5mL，缓冲液2.0mL。先加15％三氯乙酸溶液2mL，摇匀放置10min 后再加入酶液0.5mL。将上述酶促和非酶对照各管反应液室温放置15min，过滤．滤液保留，用于测定酶活力。酶活力测定：取滤液0.5mL，加入Folin—酚甲试剂4mL，混匀室温放置10min，再加Fo1in—酚乙试剂0.5mL，迅速混匀，于30℃保温30min 后，在680nm 处测光吸收值。
(三)试验结果及分析

实验做好后，把9个数据填入下表试验结果栏内，按表中数据计算出各因素的一水平试验结果总和、二水平试验结果总和、三水平试验结果总和，再取平均值(各自被3除)。最后计算极差。极差是指这一列中最好与最坏的之差，从极差的大小就可以看出哪个因素对酶活力影响最大，哪个影响最小，找出在什么条件下酶活力最高。最后作一直观分析的结论。
以A 值〔Ⅰ/3，Ⅱ/3，Ⅲ/3〕为纵坐标，因素的水平数为横坐标作图。