Western-Blot操作流程小结

yujian623

试剂配制
（一）母液
1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g
蒸馏水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl
7.4 约17ml
7.5 约16m
7.6 约15ml
8.0 约10ml
1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g
异丙醇 100ml
溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98） 12g
蒸馏水至 500ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO·12H2O（MW 358.14） 71.6g
蒸馏水至 1000ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
10％SDS SDS 10g
蒸馏水至 100ml
50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g
超纯水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）
1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g
超纯水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g
超纯水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
40％Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g
甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g
超纯水至 100ml
溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
20％Tween20 Tween20 20ml
蒸馏水至 100ml
混匀后4℃保存。
（二）使用液
单去污剂裂解液（PMSF）： 1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX-100 0.5ml
蒸馏水至 50ml
混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。
（一般实际用的比较多的其实是RIPA裂解配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。至于其中每个要加多少量那就自己去算吧，因为本人已经算好的配方表无意间弄丢了）
0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4） 0.2 mol/L NaH2PO 19ml
0.2 mol/L NaHPO4 81ml
NaCl 17g
蒸馏水至 2000ml
（如果用TBST进行洗膜的话，其实PBS用得很少，大可不必自己配制，向试剂公司购买20×的PBS浓缩液即可，500ml的浓缩液不到50元，很方便）
G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用） 考马斯亮蓝G250 100mg
95％乙醇 50ml
磷酸 100ml
蒸馏水至 1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。
0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g
蒸馏水至 100 ml
高温灭菌后，室温保存。
100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g
0.15 mol/L NaCl 1ml
溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。
10％分离胶和4％浓缩校
10％分离胶（两块胶，10ml） 4％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水 4.85ml 3.16ml
40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml
1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 2.5ml －
0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） － 1.26ml
10％SDS 100 μl 50 μl
10%AP（过硫酸胺） 50 μl 25 μl
TEMED 5 μl 5 μl
加TEMED后，立即混匀即可灌胶。
（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）
还原型5XSDS上样缓冲液 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g
SDS 0.5g
溴酚蓝 0.025
甘油 2.5ml
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 3.03g
甘氨酸（MW75.07） 18.77g
SDS 1g
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）
（可以配制成10×电泳液缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
转移缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）
（可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）
10X丽春红染液 丽春红S 2g
三氯乙酸 30g
磺基水杨酸 30g
蒸馏水至 100ml
使用时将其稀释10倍。
TBS缓冲液 1 mol/L Tris·HCl（pH7.5） 10ml
NaCl 8.8g
蒸馏水至 1000ml
（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
TBST缓冲液 20％Tween20 1.65ml
TBS 700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
封闭液 脱脂奶粉（国产，光明牌） 5g
TBST 100ml
最好现用现配。
洗脱抗体缓冲液 14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇) 700 μl（通风厨里加）
SDS 2g
0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml
超纯水至 100ml
配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。
（可用可不用）
显影液（5X） 自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中）
米吐尔 1.55g
亚硫酸钠（无水） 22.5g
碳酸钠（无水） 33.75g
溴化钾 20.95g
补水至 500ml
配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至1倍。
（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的显影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）
定影液 自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）
硫代硫酸钠 240g
亚硫酸钠（无水） 15g
冰乙酸 12.6ml
硼酸 7.5g
钾明矾 15g（水温冷至30℃以下时再加入）
加水定容至1000ml，室温保存。
（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的定影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）
抗体 用TBST稀释至一定浓度使用，建议使用杂交袋（小商品市场购买，很便宜，可以多
买一点，但是务必注意质量，千万不能漏，不然抗体就浪费了，在使用之前先检查一下杂交袋的完整性）。
化学发光试剂 分A和B两种试剂，有钱可以购买Amersham、Pierce或者Santa Cruz的，没钱的话碧云天的ECL也能凑合