脂质体逆转肿瘤多药耐药研究进展

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脂质体逆转肿瘤多药耐药研究进展

摘要:本文拟就多药耐药的机理、脂质体的一般特点、脂质体逆转肿瘤细胞多药耐药的机理、及近年来脂质体在逆转肿瘤细胞多药耐药上的研究进行综述。
主题词:多药耐药；脂质体；机理；逆转多药耐药
多药耐药(MDR)仍然是肿瘤治疗的一主要挑战，固有和获得MDR可在多种肿瘤中发生。自1970年Bielder和Riehm发现MDR以来，现在已有多种耐药机理被阐述清楚，这些包括：药物外排泵蛋白在细胞膜上的过度表达；减少药物内吞；药物灭活；靶向酶过度表达；改变药物靶向；增加DNA修复能力、减少调亡。随着对MDR机理了解深入，越来越多学者把目光投向寻找拮抗或逆转肿瘤细胞MDR，早期研究主要集中在小分子逆转剂逆转肿瘤细胞MDR，如异博定，环孢霉素A、三氟拉嗪等数种化学增敏剂，现在又有第二、第三代逆转剂相继被发现。但此类药物有明显心、肾毒性，故这些逆转剂很少真正应用于临床。近年来人们又转向其他途径寻找逆转肿瘤细胞MDR的有效方法。脂质体作为药物传释系统具有靶向释放的特点，其可增加被靶向局部药物浓度，而体液中被包载药物的浓度保持较低，从而减少被包载药物的全身毒副作用，同时也突破抗肿瘤药物的剂量限制这一特性。随着对脂质体及其与细胞相互作用研究深入，一部分学者开始把脂质体应用于肿瘤MDR的逆转，而且也取得了较好效果，使其在化疗中受到越来越多的重视。本文拟就MDR机理、脂质体与细胞的作用机制及脂质体在逆转肿瘤细胞MDR方面的研究作一综述。
1、MDR 机理
①P-糖蛋白(P-gp) P-gp是一种ATP能量依赖性的转移泵(药泵) ,通过主动转运的方式把化疗药物从细胞质或直接从质膜把药物转运出细胞,减少细胞内化疗药物聚集；改变细胞膜电势和pH环境,使药物在细胞内分布和滞留发生紊乱[1]。②多药耐药相关性蛋白(MRP) MRP在介导肿瘤细胞MDR中发挥两种功能:分布于膜上的MRP扮演外排泵的角色，借助ATP提供能量将细胞内药物主动排至细胞外；分布于胞浆中的MRP使细胞内药物局限于胞浆小室内,或使已经进入胞核的药物重新转移至胞浆中,从而使抗肿瘤药物失去与靶分子结合的机会[2]。③肺耐药蛋白(LRP) LRP可能通过两种机制引起MDR,它可使以胞核为靶点的药物不能通过核孔进入胞核,即使进入也在发生药效前被泵出核外；也可使胞质中药物进入囊泡,并通过胞吐作用排出细胞外[3]。④乳腺癌耐药相关蛋白(BCRP) 也为转运蛋白[4]。⑤谷胱苷肽及其相关系统 谷胱苷肽(GSH)和谷胱苷肽S转移酶(GST) 细胞内水平和活性升高是肿瘤细胞发生耐药的又一重要机制。GSH含量增多、GST 活性增强,一方面使药物极性增加,失去毒性；另一方面GSH与药物耦联，更易被转运出细胞，从而使细胞表现出MDR表型。⑥拓扑异构酶（TopoⅡ） TopoⅡ介导的MDR是以细胞内药物积聚障碍和对所有抗TopoⅡ药物交叉耐药为特征,主要机制有：TopoⅡ基因点突变或缺失；TopoⅡ磷酸化水平提高；TopoⅡ酶水平降低；TopoⅡα、β同功酶比值发生改变[5]。⑦凋亡相关蛋白和基因 野生型p53 (wt-p53)在细胞生长过程中以“分子警察”身份监视细胞内DNA状态。Wt-p53缺乏或发生突变,将失去“分子警察”作用,不能诱导受损细胞凋亡而使其得以生存；由于细胞失去G1期细胞周期检查点的DNA损伤监视作用,而易出现缺失、扩增和易位等染色畸变。Bcl-2和Bax蛋白间平衡是细胞接受信号后决定细胞死亡的一个检查点(checkpoint) ,这一平衡决定了细胞成活与死亡。Bcl-2过量表达可使细胞更有效地耐受化疗药物作用。Fas与相应单抗或Fas配体结合后触发细胞凋亡程序。FasmRNA及其蛋白表达水平越低,细胞耐药指数就越高。白介素-1β转换酶( ICE) 家族处于信号转导下游,能够直接导致细胞凋亡,某些抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞发生凋亡必须激活ICE 家族中的caspases。用caspase抑制剂能有效阻滞柔红霉素诱导敏感细胞发生凋亡[6]。提示凋亡抑制可能是肿瘤细胞发生MDR的一种独立机制。⑧其它因素有蛋白激酶C、蛋白激酶A、DNA损伤修复相关基因和蛋白质分子、离子通道等。
2、脂质体及其包载药物的释放
2、1 脂质体
脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，其内部为水相的闭合囊泡。由于其结构类似生物膜，故又称人工生物膜(artificial biological membrane)。根据结构不同，脂质体可分为三类①单室脂质体 球径 约≦25祄，水溶性药物的溶液只被一层类脂质双分子层所包封，脂溶性药物则分散于双分子层中。凡经超声波分散的脂质体悬液，绝大部分为单室脂质体。②多室脂质体 球径约≦100祄 ，有几层脂质双分子层将包含的药物(水溶性药物)的水分隔开，形成不均匀的聚合体，脂溶性药物则分散于脂质分子层中。③大多孔脂质体球径0.13+0.06 祄单层状，比单室脂质体可多包裹10倍的药物。
脂质体本身无特异靶向性,可在脂质双层中掺入对特异细胞具有选择性和亲合性的配体,利用细胞对配体的识别可得到专一性作用于靶细胞的靶向脂质体。在偶联剂的作用下,将天然或修饰的抗体分子偶联到含有适当功能基团的脂体上,形成免疫脂质体(ILs)。免疫脂质体作为药物载体具有独特的优点,它对机体无毒,能携带和释放各种药物,保护药物免受降解,使其分布到靶位点。目前,它已应用于临床,并取得满意的效果。
脂质体作为药物的载体具有以下优点：①脂质体载体能保护被包裹物②能有效地控制药物释放③通过改变脂质体大小和电荷，可以控制药物在组织内的分布与在血液中的清除率④改变某种物理因素，例如改变用药局部的pH、病变部位的温度等能明显改变脂质体膜的通透性，使脂质体选择性的释放药物⑤可用单克隆抗体等配体修饰脂质体，使药物靶向病变部位(即药物导弹)⑥脂质体本身对人体无毒性和免疫抑制作用。因此，脂质体在许多疾病，尤其在癌症治疗中显示出明显的优越性。
2、2 脂质体与细胞的相互作用（脂质体内药物的释放）
①细胞外释药 当脂质体进入与肿瘤部位后，在一定的外部因素作用下（如与肿瘤细胞接触﹑瘤内因代谢旺盛而局部温度升高），脂质体药物释放。在此情况下，脂质体作为药物在肿瘤内的储备库。② 表面结合脂质体的内化 蛋白质结合于细胞表面受体，在其与细胞分离之前被内化，这一过程称为受体介导的内化。通过这一过程细胞可从外界环境中摄取营养，调整细胞内蛋白成分。许多报道证实小的脂质体靶向于肿瘤细胞后通过此途径内化[7.8.9]。③与靶细胞膜或胞内膜溶融合释药 脂质体与靶细胞膜或胞内膜融合是一种主动的投药的过程。在原理上其可通过与细胞膜融合释药与脂质体通过受体介导的内吞后与核膜融合释药，靶细胞与脂质体的非特异性的粘附作用也会导致膜的融合释药。脂质体与靶细胞相互作用释药，在已有的研究中发现，每一种靶向给药并不是通过一种方式，而是一种方式为主，多种方式联合作用释药入细胞内。
3、脂质体逆转多药耐药机理
①增加药物在肿瘤组织内的药物浓度以逆转MDR：肿瘤细胞的MDR与化疗药物敏感是相对的概念，及药物浓度与细胞毒性在两细胞系之间比较，当细胞在较底浓度达到半成活时，其就为敏感的细胞，相对而言另一为耐药细胞。脂质体在肿瘤组织处聚集是利用肿瘤血管相对于正常组织渗透性增加，而淋巴系统不全的特性来实现的。研究证实：脂质体作为药物载体可增加包载药物在肿瘤组织局部的浓度可达游离药物的10倍以上 [10、11、12]。虽然在动物的肿瘤模型中有细胞耐药指数可达100，但临床的研究证实肿瘤细胞耐药指数多在2～10之间。②脂质体包载抗肿瘤药与逆转剂复合物逆转肿瘤细胞的MDR：小分子的逆转剂逆转MDR有很多成功的报道，利用脂质体包载抗肿瘤药物与小分子的MDR逆转剂而使两者在肿瘤组织局部发挥作用，同时也避免了两者的全身毒副作用。③利用免疫脂质体与肿瘤细胞的相互作用，采用介导内化的抗体作为引导装置，免疫脂质体可通过内化使大剂量的药物同时进入肿瘤细胞的细胞质或细胞核，甚至细胞内的亚细胞器，大大提高药物的生物利用度[13]，从而逆转MDR，见下图④采用抗P-GP蛋白的抗体连接于脂质体，抗P-GP蛋白可抑制P-GP蛋白泵的作用，而导致脂质体内包载的抗肿瘤药物在MDR细胞内集聚，杀伤耐药细胞⑤脂质体的一些膜成分可抑制P-GP蛋白的作用。
4、脂质体逆转MDR研究
1、普通脂质体包载抗肿瘤药逆转多药耐药
早期有许多研究应用脂质体的方式逆转肿瘤耐药，这些包括阳离子脂质体和磷脂酰乙醇胺（PC）脂质体，这一传释系统的有效性在于其可使抗肿瘤药物用量大大增加而不增加药物的毒副作用，可增加肿瘤组织与肿瘤细胞内药物的浓度，故相对于游离药物来说脂质体包载药物时可增加药物的细胞毒性。Albrecht等[14]在术前30分钟内以2㎎/㎏的剂量给肿瘤患者注射阿霉素脂质体后，分别在12～50小时内通过外科手术取出肿瘤组织及其周边组织，测定阿霉素在肿瘤及周边区的药物浓度，结果表明阿霉素在肿瘤及周边区的浓度明显大于正常组织。Cordobes等[15]以脂质体包载99mTc-MIBI (99Tcm-甲氧基异丁基异腈)研究敏感细胞和耐药细胞中放射性物质积聚与排除情况时发现，脂质体包载的在以P-GP与MRP为主导的MDR细胞与敏感细胞没有明显的区别，而游离药物在两细胞比较时区别明显，其在MDR细胞中的浓度较敏感细胞中低。Federico等[16]在临床实验中以80或100㎎/㎏剂量给白血病患者静脉注射阿霉素脂质体,在一定的间隔通过高压液相观察血、骨殖尿中阿霉素或起其代谢产物浓度，结果显示在脂质体组与游离阿霉素组血中药物浓度没有明显区别，而在血细胞中前者药物浓度明显大于后者。脂质体包载抗肿瘤药物逆转MDR的假设机理还包括脂质体直接与P-GP蛋白相互作用。中性磷脂酸如卵磷脂（PE）和 PC等是多种脂质体的主要的组成成分，其被认为是P-GP的作用的底物[17]，可与药物竞争P-GP结合位点，例如含PC和PE的脂质体使药物 的内吞增加且增加MDR细胞的细胞毒性，这一现象不仅发生在脂质体包载药物，而且也发生空白脂质体与药物的混合物，表明脂质体与细胞发生直接的作用[18]。相似的Michieli等[19]报道了阿霉素脂质体（脂质体由PC/胆固醇组成）可产生4～5倍游离阿霉素的细胞毒性。普通脂质体逆转MDR的研究中也有阳离子脂质体被肿瘤细胞内化的报道。如果内化，阳离子脂质体可提供药物直接进入肿瘤细胞的细胞器，从而绕过P-GP蛋白或其他的膜蛋白泵，这与配体介导的脂质体内药物与肿瘤细胞相互作用相似，如免疫脂质体，但阳离子脂质体在临床的动物实验中无足够的循环时间，从而在体内不稳定。
与普通脂质体逆转MDR相似的有温度与PH值敏感脂质体，但后者增加肿瘤局部药物的浓度与靶向释放更有优势。包载阿霉素的温度敏感脂质体被应用于体内治疗MCF-7乳腺癌MDR细胞，当脂质体进入肿瘤局部后，升高局部温度，结果显示MDR细胞与敏感细胞相似，生长被抑制[20]。Needham等[21]应用温度敏感脂质体治疗鳞状细胞癌取得了非常好的效果。温度敏感脂质体以得到较快的发展[22]，且非常有效，当前温度敏感脂质体以进入临床Ⅰ、Ⅱ期实验。
2、普通脂质体包载抗肿瘤药与小分子肿瘤逆转剂逆转多药耐药
许多学者在肿瘤的治疗过程中，通过应用小分子的肿瘤逆转剂与抗肿瘤药同时给予逆转肿瘤细胞的MDR，且在体外实验取得了良好的效果[23、24]。这一方式大部分是针对膜泵为基础的耐药，其理论基础是抑制膜蛋白的功能可使抗肿瘤药物在肿瘤细胞内聚集而发挥所有抗肿瘤药的作用。可是体内复合给药时，经常导致抗癌药的毒性剧增和有限的MDR肿瘤化疗敏感性增加。这显然与MDR抑制剂阻断正常组织上的膜蛋白有关，如肝和肾上的P-GP蛋白，这样就降低了抗肿瘤药物的排除。第一代MDR逆转剂（如环孢甘素A）在临床上因为他们严重的毒副作用，而限制了其在临床上的应用。脂质体有靶向性与改变包载药物的药物动力学的特性，有些学者利用这些特点，同时包载抗癌药与小分子的肿瘤细胞MDR逆转剂于脂质体来逆转肿瘤细胞的MDR。LO等[25]应用脂质体提供选择性的投药于肿瘤细胞，并比较游离的环孢甘素A和脂质体包载环孢甘素A在肿瘤细胞内的药物浓度，研究表明脂质体包载的形式大大提高药物在肿瘤细胞内的药物浓度，而且后者体液中的药物浓度大大小于前者。Sadasivan等[26]包载阿霉素与异博定治疗HL-60R，研究结果证明，包载药物治疗组的治疗效果大于阿霉素脂质体及阿霉素脂质体和异博定混合物，进一步分析这一结果提示脂质体包载阿霉素与异博定时两者可起协同作用。
3 免疫脂质体逆转肿瘤细胞MDR
免疫脂质体在选择介导内化的抗体作为自引导时，ILs可有效的投递药物于靶细胞的细胞质、细胞核、甚至细胞的亚细胞器。而且通过脂质体内化给药时可瞬间使细胞内药物浓度达到杀伤肿瘤细胞的作用，而逆转以膜蛋白泵为主导的肿瘤细胞MDR。Huwyer等[27]以抗转特铁蛋白的抗体连接于包载同位素标记的地高辛脂质体，研究药物的内化、药物在细胞内的浓度以及浓度持续时间，同时以游离药物作为对比。研究结果显示ILs在30分钟内有55%被内化。且在3小时和60小时共聚焦显微镜观察表明，3小时后药物主要位于细胞质，而60小时后仍有很高的药物浓度位于细胞核。同时以单抗和八叠氮阻断内化后，细胞内药物浓度明显减少。对照组细胞内药物浓度明显底于研究组，保持较底水平，但在加入膜蛋白泵抑制剂后，对照组细胞内药物浓度明显上升。Goren等[28]在包载阿霉素的脂质体表面连接叶酸治疗小鼠体内的耐药肺癌（M109R-HiFR），结果表明ILs的抗瘤效果明显优于游离的阿霉素及阿霉素脂质体。Suzuki等[29]以抗转铁蛋白抗体的ILs治疗K562/ADR时，发现ILs治疗效果与游离的阿霉素敏感的K562相似，而游离的阿霉素治疗K562/ADR时，其细胞内的药物浓度仅有ILs治疗组的1/45。Carrion等[30]应用抗CD34（表达于人白血病MDR的KG-a1细胞系表面）的抗体连接与阿霉素脂质体,研究其对KG-a1细胞的杀伤作用，结果显示其细胞毒性明显高于阿霉素脂质体，这表明免疫脂质体治疗效果优于脂质体。
Hamada等[31]研究MRK-16（抗P-GP蛋白抗体）发现其可抑制P-GP泵的作用。Selas等[32]比较游离的长春新碱，脂质体包载长春新碱与MRK-16与脂质体包载长春新碱在治疗结肠癌（MDR系与亲本细胞，MDR系的耐药为后者的6～7倍）时发现第三者杀伤作用最强。Masahiro等[33]根据这一发现以MRK-16连接于脂质体，研究其对白血病细胞K-562与K-561/ADM的杀伤作用时发现K-562/ADM对脂质体内的长春新碱的吞噬要低于K-562细胞。但加对照的抗体时细胞对长春新碱的吞噬并不下降，MRK-16连接的脂质体结合于K-561/ADM要大于对照抗体修饰的脂质体与无抗体修饰的脂质体，且MRK-16脂质体对K-562/ADM的杀伤作用要明显强于对照的抗体修饰的脂质体与无抗体修饰的脂质体。
结语
肿瘤细胞MDR的发生非常复杂，故在逆转MDR的过程中针对其中的一种机制很难取得较好的效果也不难理解。脂质体作为一种有效的药物传释载体，在增加药物靶向部位聚集，包括细胞质和细胞内的亚细胞器，提高药物的生物利用度有非常已被越来越多的学者所接受。当前已有多种脂质体被用于临床，且已取得较好的效果，这其中也包括对MDR肿瘤的治疗。目前脂质体在肿瘤细胞MDR的研究并不是很多，但已有足够的研究证实脂质体在肿瘤细胞MDR的重要作用，至少脂质体用于逆转以膜蛋白泵为主导的MDR被越来越多的学者所接受。我们相信随着脂质体与MDR研究的深入，脂质体在逆转肿瘤细胞MDR方面的研究也将到较快的发展。

bbsicom

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