动脉粥样硬化血管平滑肌细胞膜离子通道的研究进展

牵牛花

血管平滑肌（VSM）膜上有四种不同类型的钾离子通道、两种电压门控钙离子（voltage gated Ca2+）通道、两种氯离子通道、储存操纵钙离子（store operated Ca2+,SOC）通道及牵张激活阳离子（stretch activated cation ,SAC）通道。钾离子通道分别为电压激活性钾（voltage activate K, Kv）通道、大电导钙激活性钾（large conductance，BKCa）通道、内向整流性钾（inwardrectifier K，KIR）通道、ATP敏感性钾（ATP sensitive K，KATP）通道；钙离子通道为L型电压门控钙通道及T型钙通道；氯离子通道分别为钙激活氯（Ca2+ activated Cl，Cl Ca）通道及容积调节氯（volume regulated Cl，Cl VR）通道。动脉平滑肌细胞膜电位是动脉张力及动脉直径的主要调节因素，而实验证明细胞膜电位主要由钾离子通道控制。动脉平滑肌细胞膜钾离子通道开放可促进钾离子外流，并导致膜电位超级化，使膜上电压依赖性钙通道关闭，Ca2+内流减少，从而导致VSM舒张。许多内源性血管扩张剂如降钙素基因相关肽（CGRP）和腺苷等主要是通过激活ATP敏感性钾通道使平滑肌细胞超极化，降低血管壁张力，维持血管舒张状态。Wilde等对成年犬冠状动脉平滑肌细胞研究发现K Ca通道能直接对抗Ca2+通道活动所致的膜去极化而引起膜超极化，提示此通道可能对抗冠脉平滑肌的去极化和紧张性中起着保护作用。降低血管内压力或阻断Ca2+通道以降低细胞内Ca2+浓度，并以此来降低主动脉张力，这将大大消弱钾通道阻断剂对膜电位和动脉张力的作用。

VSM细胞增殖与凋亡时离子通道的改变

细胞内的K在控制细胞内离子平衡及抑制凋亡酶活性方面起重要作用。羰基氰化物即p-三氟甲基羰基腙（FCCP）可诱导多种类型细胞的凋亡，在鼠和人肺动脉平滑肌细胞（PASMC）中，FCCP可开放BKCa 通道，增加K电流及诱导凋亡。四乙铵（TEA）和iberiotoxin通过阻滞纤维膜上的BKCa通道减少K电流并抑制FCCP诱导的PASMC凋亡。而且，通过提高细胞外K浓度，抑制K外流，也可以减少由FCCP及缬氨霉素引起的PASMC凋亡。提示FCCP介导的PASMC凋亡部分是由于BKCa通道活动增加所致，BKCa通道可能是调节细胞凋亡的机制之一。一氧化氮（NO）是一种调节VSM细胞增殖与凋亡的内源性内皮细胞舒张因子。Krick等研究NO诱导人与鼠PASMC凋亡的机制，PASMC暴露于NO增加细胞凋亡的百分数，增加细胞外K浓度到40mmol/L或用1ml TEA阻滞K通道科明显抑制NO诱导的细胞凋亡。在单个PASMC中，NO通过BKCa可逆地增加K电流，TEA存在时，NO通过电压依赖性钾通道也增加K电流，而4氨基氮苯明显减少电压依赖性钾通道K电流，用0.3mmol/L脱氢表雄酮开放钙激活性钾通道可引起细胞凋亡，并进一步增强NO介导的细胞凋亡，而且NO使线粒体膜电位去极化。这些结果提示NO通过激活钙激活性钾通道和电压依赖性钾通道来诱导细胞凋亡，K外流增加导致细胞质中的K丧失并最终导致细胞体积减少及细胞凋亡，NO诱导地细胞凋亡也可能与PASMC线粒体膜的去极化有关。

AS时VSM细胞膜离子通道的改变

已知VSM细胞与AS发生与发展密切相关，VSM细胞的增殖与异常活动在AS斑块形成中起着中心作用，斑块中的SMC具有类似于胎儿未成熟SMC的某些形态学与生物化学特性，而收缩性表现是典型的正常成年人动脉SMC型。在VSM细胞中BKCa分布广泛，起着重要的生理作用。有报道成年人与胎儿主动脉SMC中的BKCa具有动力学差异。Bolotina等对AS人主动脉平滑肌细胞与正常人主动脉平滑肌细胞BKCa的特性进行了研究。发现正常人主动脉平滑肌细胞具有一种同一性质的正常Ca2+依赖性K通道：L型通道和s型通道。在相似的条件下，s型通道平均开放时间大约短4倍，达到L型通道开放的概率需要细胞内Ca2+依赖性K通道。因此，表明s型Ca2+依赖性K通道存在于AS平滑肌细胞中，它与AS发生发展有关。Wiecha等对冠状AS斑块平滑肌细胞（SMCP）与正常冠状动脉平滑肌细胞（SMCM）BKCa的特性进行了比较研究。两组平滑肌细胞BKCa都具有电压依赖性激活特性，在140mmol/L K溶液中SMCP单通道电导为216.4±16.7 p S，SMCM为199.9±6.7 p S。应用外面向外膜片记录，细胞外灌注5000mmol/L TEA 引起一种典型单一电流的“闪乐阻滞”。选择性BKCa通道抑制iberotoxin（50 nmol/L）可有效地阻滞BKCa有较高的通道激活。用细胞吸附膜片记录，在正80mV时比较BKCa开放状态概率，SMCP和SMCM两组间差异具有显著性。用内面向外膜片记录，两组间BKCa开放状态概率差异没有显著性。表明AS斑块平滑肌细胞BKCa比正常冠状动脉平滑肌细胞BKCa有较高的通道活性。这意味着BKCa通道在AS的发生与发展中起着重要的作用。Cox等研究了AS新西兰兔门静脉收缩性和离子通道的改变。用全细胞膜片钳技术记录肌细胞的Ca2+和K电流（ICa和IK）。胆固醇饲料增加了血浆胆固醇的水平并增加了门静脉的胆固醇与磷脂比率。AS门静脉对血清素最大收缩反应较大，去甲肾上腺素和血清素引起AS门静脉的收缩活动应激曲线向左移。AS肌细胞与对照组肌细胞比较，ICa的最大值较大，ICa的电压依赖性激活向更负电压漂移。AS肌细胞的K全细胞电流较小，平均为7.7±0.8pA/pF，而对照组平均为14.9±2.8 pA/pF，AS肌细胞的IK尾电流更小。

离子通道与抗AS药物

膜片钳技术的一大优点就是在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位（膜内或膜外）施加各种浓度的药物或毒素，研究它们对通道功能的可能影响。通过研究，一方面可深入了解哪些选择性于通道的药物和毒素影响人和动物生理功能的分子机制；另一方面，分析各种药物对通道蛋白的选择性相互作用的特点，提供有关通道蛋白亚单位结构与功能关系的信息。Asano等研究了N3甘油戊烯酸（n3 eicosapentaenoicacid，EPA）对VSM细胞内Ca2+浓度和膜电位的影响，发现长期应用EPA可产生低血压效应并对AS治疗有益。为了阐明这些效果的机制，应用Fura2显微荧光测钙技术和膜片钳技术，测量经EPA处理的鼠VSM细胞内钙浓度、静息膜电位、磷脂脂肪酸成分及VSM细胞迁移的改变。经EPA处理后的细胞，磷脂部分的EPA和DPA（docosapentaenoic acid）浓度呈时间依赖性增加，花生四烯酸（arachidonicacid，AA）浓度减少，EPA和AA的比率显著性增加，与对照组比较细胞内Ca2+浓度降低。血管加压素，内皮素1和血小板源生长因子（PDGF）可引起细胞内钙增加并出现一次峰值，随后出现一个较小的钙持续增加。经EPA处理的细胞与对照组细胞比较，这些拮抗剂引起细胞内出现的钙峰和持续降低。在电流钳条件下，经EPA处理的细胞与对照组细胞比较，静息膜电位显著性的增高，细胞的输入阻抗较低，而细胞大小和电容没有统计学差异。另外，经EPA长期可显著性地抑制PDGF诱导的细胞迁移。这些结果表明EPA的细胞内作用为降低细胞内钙浓度并影响细胞膜电位，从而抑制VSM细胞的迁移。EPA的这些作用有助于血管弛缓和抗AS作用。Beaughard等应用膜片钳技术对一种新的有潜力的抗AS剂（Org13061）进行研究，比较了它的对映异构体钙拮抗性和抗氧化性。结果显示外消旋Org13061选择性阻断电压操纵钙通道（voltage operated channels，VOCs）并具有抗氧化作用，内消旋Org13061对VOCs的阻断起主要作用，但作为抗氧化剂，两者的作用相同。Org13061这种混合药理作用可能对AS治疗具有潜在的用处。膜片钳技术能分辨通过细胞膜单个通道的电流，从而可对通道的电学及其动力学特性、药理学特性，以及通道的调节机制开展深入的研究，并为通道的分型提供可靠的新的标准，进而发现并区分出了许多新的通道类型。运用膜片钳技术研究ASVSM细胞的膜离子通道电生理特性，发现VSM细胞的凋亡与K通道活动增加有关；在AS发生与发展过程中BKCa起着重要的功能作用；某些药物影响ASVSM细胞离子通道而发挥作用。因此，对VSM细胞膜离子通道深入研究将给AS发病机制及药物开发带来新的亮点。