显微切割技术在RNA研究上的应用

yujian623

RNA作为从DNA到蛋白的生命过程中不可缺少的重要生物大分子，一直是基因表达研究的重要材料。随着分子生物学研究技术的发展，研究者已经可以使用众多高通量和高精度的研究方法来进行基因表达研究：如用基因芯片技术同时对大量的基因表达的变化进行研究，或用定量PCR技术对几个重点基因进行研究等。但是，困扰研究者多年的，仍旧是研究的最初――很难取得感兴趣的单一类型的待研究细胞或组织，这使整个研究的灵敏度和重复性受到了很大的影响。我们知道，无论正常组织或是病变组织均由众多不同类型的细胞组成，即使肿瘤块，仍混有正常细胞和癌变细胞，同时癌变细胞中还包含不同的发展阶段，其基因表达可能会存在很大的差异。使用常规的混合样本（如通过组织块匀浆获得的核酸样本）进行研究，会有很多有用的信息被淹没在众多的背景信息中，不仅影响实验的可靠性，无法找出真正相关细胞的表达情况，也很难比较不同类型细胞的基因表达变化，对诸如原位癌、上皮不典型增生、癌克隆起源和精子发生学等方面的研究尤其如此。　　为了解决以上问题，数十年前研究者就开始尝试使用各种方法获得单一类型的细胞和组织。最早，人们使用刀片、针头等，在显微镜下人工对需要的组织进行分离；随着显微操作术的发展，又出现了半自动机械控制的显微切割，但分离的速度、精度，和操作的方便程度，仍不能满足实验的需求：其复杂且麻烦的显微切割步骤，不仅对操作人员的技术有很高要求，而且操作过程很长，对于后续是RNA操作的研究尤为致命，很难保证分离得到的样本的RNA的完整性。直到激光辅助的显微切割技术的引入，以上这些问题才真正得以解决。以下我们先简单介绍一下激光显微切割的技术原理，再重点看看它在RNA研究领域的主要应用。1. 激光显微切割的原理：铺片：将待分离样本按常规制备方法，铺在一张附有薄膜的托片上。如果是准备后续进行RNA操作的组织切片，要注意所有使用的试剂、溶液、工具和操作环境要保持RNase free↓三明治保护结构：将铺有样本的托片翻转后放置在一张载玻片上，形成三明治保护结构。样本被保护在膜和玻片之间，切割时免受外界环境的污染，最大限度地防止RNA降解↓放置收集管盖：把一个有一定黏性的Eppendorf管盖放置在准备好的组织切片的膜上用于切割样品的收集，同时它还有散射体的作用，能显著提高样本的成像质量↓选择切割目标：通过CCD摄像机，在屏幕上实时监控待分离的样本，使用鼠标勾画选择目标细胞或组织，也可将不同类型的细胞分几组同时勾画出来↓　　全自动激光显微切割：完成样本选择后，只需点击切割键，软件即自动控制载物台依次完成显微切割；若使用分组切割功能，只需在每组分离之间更换Eppendorf收集管；↓收集切割样品：切割完成后，提起Eppendorf管，由于管盖具有黏性，切割下来的膜和样本即被黏附在管盖上，至此完成了显微分离的操作；还可将Eppendorf管盖放置在样片空白处，再次观察分离下来的样本的原位形态，为研究提供良好质控↓样品后续实验：DNA提取；RNA提取；蛋白提取 ……2. 显微切割在RNA研究上的应用：　　基因表达是RNA研究的热点领域之一，而基因芯片（gene chip）或微阵列（Microarray）的高速发展使我们在基因组水平上高通量大规模地研究基因表达谱成为可能，由此还衍生出了转录组（tranome）等新的研究方向。然而，尽管芯片技术可以在一次实验中检测大量的基因表达变化，但若使用混合样本，一些低表达基因的表达变化则很有可能被淹没在众多的背景信息当中。　　举个例子来说，在对乳腺癌样本的基因表达情况进行研究时，如果采用一般的病变组织块匀浆处理后抽提的RNA进行杂交，结果会发现Proteoglycan 1和CD53 antigen基因表达量较高，Proteosome subunit基因相对较低。但在癌变的细胞中，真实的情况是不是这样的呢？我们采用显微切割技术，将癌变细胞特异地切割下来，再使用同样的后续处理方法进行研究就可以发现，在单纯的癌变细胞中，Proteosome subunit基因的表达量远远高于Proteoglycan 1和CD53 antigen基因。是什么原因导致两次分析的结果差别如此巨大呢？简单分析后不难发现，问题之所在是：最初的实验使用的是混合样本！由于正常细胞中Proteoglycan 1和CD53 antigen属于表达量很高的基因，而Proteosome subunit基因表达量相对要低很多，因此使用混合的组织样本就导致了癌变细胞中的真实基因表达情况淹没在正常细胞的背景信号中，很难发现癌变细胞中真实的基因表达情况。这时候，使用显微切割技术，从混合的组织样本中将需要研究的细胞特异的分离出来，就可能发现以往使用混合样本无法发现的肿瘤表达标签。同样，显微切割技术还可以和定量RCR技术相结合，对单一类型样本中的一些基因进行重点研究，得到准确的，高灵敏度的核酸定量分析结果。　　此外，由于RNA本身很容易降解，被污染，在具体操作时除了要遵循RNA操作的整套基本流程（可参见本刊实验指南部分），如所有溶液和器皿都需保证RNase free，最好在专门的RNA操作室进行，操作尽量迅速等等外，目前市面上已经有一些经过优化的商业化产品能够最大化地防止污染，简化操作及实验条件的摸索，保证RNA来源样本的显微切割的顺利进行及后续处理。以下就一般的实验过程中涉及的关键步骤给大家简单介绍一下。　　首先，一套好的显微切割系统对实验的结果非常关键，以瑞士MMI（Moleculer Machines&Industries）最新开发的SL μCUT全自动高精度显微切割系统为例，它已经为RNA来源样本的分离提供了很多特性设计：其一，整个流程包括样品成像、目标选择、显微切割、切割前后结果照片的拍摄，样本收集都实现了高度自动化，其激光聚焦，更换视野及载物台移动，更换物镜后的CCD参数设置转换等完全由软件控制，点击鼠标即可完成，快速简捷；其二，对靶目标的选择方式也非常方便灵活：可以先对整张样片进行快速扫描以便迅速确定目标区域；提供多种绘图工具甚至可选用触摸屏配套笔直接在触摸屏上勾画；还有分组切割功能，可一次性选择多组细胞，并自动计算出每组的总选择面积；甚至在一些细节上，这套系统也考虑得很周到，如三明治结构的样片，样品被很好地保护在托片膜和载玻片之间，免受外界污染，在整个分离过程中，激光都不与需要分离的样本接触，对样本损伤小，甚至可以进行活细胞分离再培养。　　此外，相对于常规的使用混合样本的实验，通过显微切割得到的单一类型样本的RNA量一般要小得多，很多时候需要对下游操作进行一些优化，在保证质量的同时提高得率。对于微量样本，QIAGEN公司的RNeasy Micro Kit就是一个很好的RNA纯化工具，它最少可从1个细胞中提取RNA，再配上该公司的能进行单细胞逆转录反应的RT及高灵敏度的PCR试剂盒，能最大限度地减少实验条件的摸索，保证成功率。如果分离的样品后续用作芯片方面的研究，往往需要对mRNA进行线性扩增，以获得足够的待测样本与芯片进行杂交。RNA线性扩增技术的重要特点是保证mRNA在扩增的过程中，保持原有的丰度不变，从而可以比较各基因实际表达量的差别。在有些样本量非常小的情况下，可能还需要进行两轮的线性扩增以得到足够的目标样本。在这方面，激光辅助的显微分离技术与RNA线性扩增和基因芯片技术相结合的典型的例子是，它使研究者首次可以建立单一类型细胞的基因表达数据库，比较不同类型细胞的基因表达差异。3. 总结及展望：综上所述，激光辅助的显微分离技术拓宽了基因组学研究的领域和精度，更为分子肿瘤学的发展提供了不可替代的帮助，已日渐成为不可替代的支柱技术之一。 近年来，随着显微切割技术的不断发展，又出现了越来越多新的应用。例如，由于高精度激光器和电动载物台的配套，可进行高精度的显微切割，甚至是特定染色体的显微切割；一些独特的分离原理和相应耗材的引入，可进行培养细胞的显微分离，分离得到的样本可以进行后续培养，这对于从一些肿瘤组织中分离出单一类型肿瘤细胞，避免其它生长旺盛的杂细胞对后续培养建系时的干扰有一定意义；此外，有些激光辅助的显微分离系统还具有很好的可升级性，可加配激光光镊系统，进行单分子科学研究。我们相信，显微切割技术这项日臻完美的技术必将在更多的领域发挥更大的作用。