肿瘤基因治疗

牛惠生

肿瘤基因治疗
　　肿瘤基因治疗的目的基因主要包括细胞因子、MHC分子、协同刺激分子、抗癌基因、反义核酸、肿瘤药物相关基因及病毒基因等。
2.1 免疫基因治疗

免疫基因治疗是指利用基因进行免疫治疗，包括细胞因子基因治疗、基于DNA的疫苗、单克隆抗体基因转移等。基因免疫方法比其他体内基因转移方法上有更大的优越性：不需要佐剂，能够同时诱导机体的体液及细胞免疫；在细胞内合成抗原，经加工后与MHC-I、II类分子结合并呈给CD8+和CD4+I细胞，质粒DNA注射到肌肉内表达可长达19个月之久，即可实验长久免疫；外源基因直接在宿主体细胞内完成表达和后加工，能完整地保留产物的天然结构和抗原性；质粒DNA或RNA的相对分子质量较小，一般不会刺激机体产生抗DNA和RNA的抗体，多次免疫；免疫用的KNA可以像普通药物一样按标准的方法大量制备，价格便宜，等等。质料DNA体内直接注射法在抗肿瘤免疫治疗中具有广阔的前景。
2.1.1 肿瘤的细胞因子基因治疗

2.1.1.1 细胞因子概念
细胞因子是一类由免疫细胞（淋巴细胞、单核巨唾细胞等）和相关细胞（成纤维细胞、内皮细胞等）产生的调节细胞功能的高活性、多功能蛋白质多肽分子，不包括免疫球蛋白、补体和一般生理性细胞产物。目前已发现并命名的细胞因子有数十种，每种细胞因子均有其独特的、起主要作用的生物学特征。
2.1.1.2 细胞因子分类
根据作用的靶细胞不同，可分为：作用于淋巴细胞的细胞因子；作用于单核巨唾细胞的细胞因子与作用于白细胞的细胞因子；作用于其他类型细胞的细胞因子。
根据细胞因子的作用机制，可分为：效应性细胞因子与调节性细胞因子。
根据产生细胞的不同，可分为：由淋巴细胞产生的细胞因子，如大多数白细胞介素；由单核巨噬细胞产生的细胞因子，如IL-1、IL-8、TNF；其他细胞产生的细胞因子，如由基质细胞产生的IL-7。
根据功能及与免疫学的关系，可分为：具有抗病毒活笥的细胞因子，主要包括IFN；具有免疫调节活性的细胞因子，包括IL-2、4、5、7、9、10、12及B型转化生长因子（TGF-B）；具有炎症介导活性的细胞因子，包括INF，IL-1、6、8为代表一类结构相似的小分了的赵化因子；具有造血生长活性的细胞因子，包括IL-3、11、CSF，EPO，干细胞因子（SCF），白血病抑制因子（LIF）等。
在肿瘤免疫基因治疗中，IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-13及a、r-IFN、GCM、CSF等细胞因子被广泛用于实验治疗研究。
2.1.1.3 细胞因子基因疗法
（1）过继性免疫疗法
该疗法又称免疫效应细胞介导的细胞因子基因治疗，是将细胞因子基因导入抗肿瘤免疫效应细胞中，使之抗肿瘤作用增强，并以免疫效应细胞为载体细胞，将细胞因子基因携带至全内靶部位，使细胞因子局部浓度提高，从而更有效地激活肿瘤局部及周围的抗肿瘤免疫功能 ，即过继性免疫疗法。目前可用于肿瘤免疫治疗的效庆细胞有TIL，LAK，CTL，TAL（Tumor activiated lymphcyte），巨噬细胞（mФ）。
（2）以成纤维细胞等作为载体细胞介导的细胞因子基因疗法：利用成纤维细胞、内皮细胞、骨髓细胞等易于获取和培养，生命周期长的细胞作为载体，通过基因转染后并维持较长时间，以充分发挥治疗作用。
（3）直接体内注射途径：采用注射方法直接将细胞因子基因导入体内，并使之表达发挥治疗作用。如将裸露的细胞因子基因表达质粒进行肌肉注射，将脂质体包裹的细胞因子基因表达载体给于腹腔内或瘤体内注射，将携带细胞因子基因的痘茵病毒或腺病毒体内注射等。
（4）肿瘤细胞主动性免疫治疗：又称肿瘤细胞靶向的细胞因子基因治疗，即将细胞因子基因或免疫相关抗原基因转染入肿瘤细胞中，制备出免疫原性更强的新型瘤苗，以激发、增强机体产生显著的抗肿瘤免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。
（5）瘤细胞靶向的细胞因子受体基因治疗：该法是增加肿瘤靶细胞对细胞因子作用敏感性的方法。通过细胞因子受体基因转染的方法，使肿瘤细胞表面相应的细胞因子受体表达增多，使对肿瘤细胞有直接生长抑制或杀伤作用的细胞因子结合增多，从而将大大增强细胞因子的抗肿瘤效果。
2.1.2 基于DNA的疫苗
DNA疫苗由来自病原微生物或肿瘤细胞有编码基因的非复制型DNA质粒组成。将编码不同蛋白的质粒接种于体内，可导致机体T细胞和相应抗体对这些蛋白的应答，因而提供了一种特异性免疫手段。优点有：①没有导入可能与“减毒”疫苗相关的强毒力病毒的危险性；②易于大量制备，价格便宜；③可以干粉形式长期保存；④小剂量适当的基因构建于即可诱导保护性免疫；⑤使用一次即能产生长期史疫力。接种DNA疫苗可用于病毒诊发的肿瘤。抗病毒的预防性免疫接种可降低肿瘤发病率。近年来，DNA疫苗领域发展迅猛，想念在不久的将来有实用的癌症疫苗制剂。
2.1.3 单抗基因转移
机体对肿瘤的免疫应答一般较弱，可能与T辅助细胞的应签作用的失败有关。用单抗基因修饰肿瘤细胞，在单抗基因转移后，肿瘤细胞能产生自我反应毒性抗体。
2.1.4 肿瘤内粘附分子（ICAM）-1转移及表达

ICAM-1与细胞迁移至炎性部位有关，也具有协同刺激T细胞功能作用。在细胞介导的细胞毒作用中，ICAM-1有助于淋巴细胞与肿瘤细胞之间的相互作用。
2.1.5 免疫细胞基因转移

利用抗原递呈细胞（APC，如树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、活化的T细胞）递呈抗原并激活T细胞的能力，先从稳步周血分离、扩增细胞，再导入肿瘤相关抗原基因，证明基因表达后回输给病人，以激活体内的T细胞，产生抗肿瘤特异性免疫反应。树突状细胞（Dendrite cells,DCs）可源于各种不同细胞如外周血单核细胞，骨髓或CD34+脐血细胞，是诊导原代T淋巴细胞反应的最强的抗原递呈细胞。采用遗传修饰淋巴细胞，以产生和分泌针对肿瘤细胞表达的癌蛋白的靶向毒素，可使其成为一类新的杀伤细胞。
2.1.6 其 他
通过基因转染，诱导肿瘤细胞I型主要组织相容性复合物（MHC）升高，从而使其免疫原性增加，肿瘤原性降低，非DNA的癌胚抗原（CEA）多聚核苷酸疫苗及多肽疫苗的研究等，都为肿瘤基因免疫治疗提供了新的方向和希望。
2.2 修正癌细胞基因缺陷

与癌基因有关的基因治疗包括反义核苷酸封闭或阻断癌基因、抑癌基因的导入或修饰、将癌基因产物作为“疫苗”的主动免疫治疗等。
2.2.1 反义技术

基因治反义技术（Antisene approach）即反义基因疗法，是指利用一些物质干扰细胞中遗传住处天然加工的方法，特别是在基因变异导致疾病的情况下。反义技术的原理是通过阻抑从DNA至mRNA的转录过程或从mRNA到蛋白质的翻译过程，而阻断细胞中的蛋白质合成。导入细胞的反义分子充当了“分子解剖刀”的作用，可以去除细胞中某些特定的蛋白质或明显抑制其合成。通过适当的载体进行转染以产生质粒衍生的反义mRNA可内源性抑制翻译；通过反义寡核苷酸可外源性抑制翻译；各种亚类反义物质如反义序列、反基因序列和核酶可在不同位点阻断转录或翻译过程。
2.2.1.1 反义寡核苷酸
反义寡核苷酸主要包括反义DNA、反义RNA和核酸，这些DNA或RNA片段进入体内可有效地抑制肿瘤肿瘤基因的转录和表达。该法的研究方向主要围红其进入细胞的效率和抗降解方法。
反义技术的优点：
（1）反义化合物的靶点是引起肿瘤的基因，通过调控基因产物的表达而发挥治疗作用。当致病蛋白质大量存在时，针对蛋白质的传统药物难以治疗的情况下，反义治疗是一种较为有效的治疗方法。
（2）反义化合物可用于治疗传统药物不能治愈的基因疾病。
（3）反义治疗比表达载体基因治疗更为安全有效，不良反应更少。
（4）用于反义治疗的化合物的费用可能比传统药物更为低廉。
反义技术的缺点
（1）不易获得定向靶组织的反义药物。
（2）寡脱氧核苷酸（Oligodeoxyuncleotide,ODN）是一段合成的DNA，易受到体内广泛存在的核酸酶的破坏，故血浆中ODN的半衰期较短。
（3）作用模式存在不确定性，动物模型显示有潜在的毒性。
（4）大多数ODN导入细胞的研究集中于细胞质膜的穿入或内吞物质释放进入细胞质。
在癌症反义治疗中，可利用反义药物消除癌基因的表达。反义ODN抗肿瘤作用的机制有：
（1）抑制癌其因，如用与原癌基因C-met mRNA互补的反义ODN可达到遏制肿瘤生长效果；
（2）通过反义ras逆转亚性表型；
（3）通过靶向细胞信号转导抑制肿瘤生长；
（4）抑制生长因子表达，反义ODN可抑制生长在子，可能成为治疗激素非敏感性乳腺癌及前列腺癌的药物；
（5）抑制融合基因，靶向融合基因的反义ODN可抑制Ewing肉瘤和神经外胚层肿瘤细胞的EWS-Fli融合基因，可用以治疗这两种肿瘤；
（6）增强化疗效果，如反义ODN与化疗联合应用或使用针对MDR的反义ODN；
（7）其他，如抑制端粒酶；用与bcl-2mRNA互补的反义ODN下调其表达，减弱bcl-2的抗凋亡作用；用以反义抑制免疫抑制功能，使免疫恢复正常，等等。
反义化合物ISIS3521是蛋白激酶C抑制剂，在临床试验中显示出抗肿瘤活性。反义技术中，如何使寡核苷酸通过化学修饰以获得组织定向性，并减少对其降解和提高其稳定性显得到关重要。
2.2.1.2 核酶
核酶是指由RNA组成的酶，可催化RNA切割和RNA剪接反应。具有催化RNA切割的核酶可作为基因表达和病毒复制的抑制剂，已被用于基因治疗研究。与传统药物不同，核酶是破坏遗传住处流，而不抑制蛋白制功能。核酶靶向特定mRNA的治疗潜力很大，特别是在治疗因RNA异常表达所致的疾病如癌症和病毒感染性疾病方面。多种癌症模型研究显示，核酶优于反义寡核苷酸治疗。
2.2.2 插入抗癌基因

P53是最重要的抗癌基因，其突变与肿瘤的发生、发展及细胞凋亡、化疗敏感性有关。体外培养的肿瘤细胞能被插入的野生型P53逆转为正常细胞。P21基因是编码周期依整性激酶抑制子的基因，能影响细胞周期的进展。P21基因转移入恶性细胞可使其进入不可逆的终分化途径，从而抑制肿瘤细胞生长。
2.2.3 根除癌基因的表达
反义技术可用于消除和抑制癌基因。
2.3 造血基因转移
2.3.1 造血干细胞（HSCs）和前驱细胞的遗传修饰
HSCs仅占骨髓细胞的1/10万以下。将基因转入人造血干细胞可提高抗癌免疫，并可提高人体对化疗的耐受性。应用HSCs进行基因治疗的优点有：HSCs可自我更新，故只需要单次治疗；具有多能性；可达到有效转导；不致癌等。基因转入HSCs可用于治疗遗传病、自身免疫性疾病及癌症等。作为接受化疗和/或放疗的癌症病人的辅助治疗也有诱人的前景，如将多药耐药基因（MDRl）等引入人骨髓造血干细胞，可降低化疗对骨髓的毒性，提高化疗用药剂量。
2.3.2 肿瘤浸润淋巴细胞基因标记及治疗
肿瘤浸润林巴细胞（TIL）是浸润到实体瘤的淋巴样细胞。TIL输入后能保留在瘤灶部位并持续较长时间。用缺陷的人逆转录病毒转染TIL输注后监测，该法安全并敏感。
2.4 分子化疗
2.4.1 基因导向酶解药物前体治疗（GDEPT）
GDEPT是通过利用肿瘤细胞和正常细胞之间基因表达的差异，使某一酶基因仅在肿瘤细胞转录表达，以增加肿瘤基因治疗破坏细胞的特异性。GDEPT系统的作用机制如下：①分子开关，把酶基因选择性连接到特殊类型的肿瘤细胞元件上；②酶药物前体结合，产生具有选择性的细胞毒性药物。酶可以是低水平表达的内源性的酶，或是由重组基因产生的非内源性的酶。药物前体是在体外无毒性，但内体内能被转变为高活性细胞毒性药物的化学剂。药物前体应具有以下特性：①药物前体和相应的活性药物的细胞毒作用的差异应尽可能大；②应是所表达酶的良好底物；③能穿过肿瘤细胞膜进入细胞内；④活性药物应能弥散，被旁边细胞摄取，以获得旁观者杀伤效应。在肿瘤细胞中，有许多原癌基因如以c-erbB-2，组织特异性启动子如PSA、AFP、NAE、甲状腺球蛋白等被激活而过度表达，其启动子是相应肿瘤细胞选择性控制酶基因表达的候选启动子。应用GDEPT系统进行靶向治疗成功的事例很多，如用编码酷氨酸激酶的基因启动子靶向黑色素瘤细胞，用CEA基因启动子靶向胃肠上皮起源的肿瘤细胞，用上皮粘蛋白（MUC）-1基因启动子靶向乳腺癌细胞等等。
2.4.2 插入自杀基因
自杀基因治疗将编码某一敏感性因子的基因转入靶肿瘤细胞，使该细胞对换某种原本无毒或低毒的药物产生特异的敏感性而死亡。这一表达敏感性因子的基因称为药物敏感基因或自杀基因。因这些基因多是由病毒载体转移入靶细胞，故该方法又称为病毒异向的酶解药物前体疗法（VDEPT）。多数自杀基因疗法研究是通过编码病毒或细菌的酶来介导药物敏感性，即肿瘤细胞产生的酶把药物的无活性形式转化为毒性代谢产物，从而抑制核酸合成。常用自杀基因有单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因、大肠杆菌胞嘧基因等。如细胞色素氧化酶P450催化环磷酰胺（CTX）转变为磷酸胺氮芥，才能发挥抗肿瘤活性，将其基因导入乳腺癌细胞株MCF-7，CTX对转导细胞有高度的细胞毒笥，且基因表达的细胞对邻近未传染的细胞有较强的旁路细胞毒效应（旁观者杀伤效应）。旁观者杀伤没有肿属特异性。
自杀基因治疗的缺点是仅杀伤S期细胞，即仅能诱导一小部分分裂细胞发生死亡。
2.4.3 肿瘤细胞药物增敏基因治疗
该疗法是指将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对药物的敏感性。如将钙调素基因转入癌细胞，利用其对癌细胞MDR的逆转作用，使癌细胞对化疗药物的敏感性明显提高。
2.4.4 肿瘤耐药基因治疗
通过基因转移技术转移耐药基因到正常器官组织，以保护其免受化疗药物的毒性作用。该疗法可以提高化疗效果。目前，肿瘤耐药基因治疗的方案是转入MDRI基因、DHFR基因、MGMT基因等，或者联合使用两种或多种耐药基因转入造血干细胞，使造血干细胞获得广谱抗药性；或使用耐药基因的突变体，以获得比野生型更有效的骨髓保护作用；也有将GM-CSF基因等转入骨髓细胞，以提高机体对大剂量化疗的耐受力。
2.5 肿瘤靶向基因治疗
2.5.1 靶向病毒相关癌的治疗
有些人类肿瘤与病毒的有高度相关性病毒基因在肿瘤细胞的表达，提供了高选择性靶向表达治疗载体转入肿瘤细胞的方法。如人乳头瘤病毒（HPV）存在于宫颈癌、口腔癌及皮肤癌等，但在正常组织缺乏。HPV的特续表达可能是这些癌症生长所必须的。用核酶、反义物及免疫基因治疗能对抗这些癌症中HPV及其产物，而达到治疗目的。
2.5.2 通过一分子连接载体细胞的特异性治疗
不同的细胞特异性配基可传送载有核酸到特异的细胞，即提供一种靶向传输系统治疗癌症。这一系统在体外能迅速分解核酸、表达载体和治疗基因，可能也适用于体内基因治疗。
2.5.3 通过位点控制区（LCR）技术的靶向非病毒基因治疗
该法是一种非病毒基因转移方法。治疗性基因附着在LCR本身的活性由其将要作用的细胞类型特异蛋白触发。
2.5.4 转录靶向癌基因治疗
当肿瘤如恶性脑瘤进入分裂期后，用重组逆转录病毒载体靶向传送自杀基因，而正常脑组织不被感染。
2.5.5 其他
HERS2靶向基因转移、靶向表皮生长因子（EGF）介异的DNA传递及靶向乏氧细胞的基因表达等都为靶向治疗剂在肿瘤特异性表达展示了诱人的潜力和前景。
2.6 病毒介导的肿瘤溶解
用在肿瘤细胞内复制的突变的腺病毒作为癌溶解剂而无须加治疗基因，能有效地治疗肿瘤。如部分缺失EIB的腺病毒可特异性在缺乏P53的肿瘤细胞内复制。同时对腺病毒的免疫应答可以限制其播散到相邻细胞。理想的肿瘤溶解病毒应有肿瘤特异性、不应速合到人基因组，并且逆转为野生型病毒的可能性极低。假如采用致病病毒，应使用有效的抗病毒药物。
2.7 靶向肿瘤血管生成的基因治疗
选择性靶向血管内皮的基因治疗，应具备三个条件：肿瘤特性的确定；有选择性破坏肿瘤内皮的方法；有引导该产物的基因传统系统。通过该途径的基因治疗研究正在进行中。
2.8 利用热休克蛋白基因的体内基因治疗
用分支杆菌热休克蛋白（HSP）基因转染肿瘤细胞，使其丧失了形成肿瘤的能力，并保护免疫缺陷鼠不受未修饰的肿瘤细胞的致死性作用。
2.9 基因疗法与放射治疗的联合
实验研究表明，如果遗传物质被转入细胞内，用粒子照射可更有效地治疗肿瘤。可能的途径及机制有：离子射线有助于基因转移；离子射线有基因诱导作用，即肿瘤细胞有放射诱导性启动子的特性；调节基因表达可以提高放射后细胞凋亡；择入DNA的药物可提高射线诱导性细胞死亡。另外还有放射性核素HSK-tk自杀基因疗法，遗传操作以降低乏氧并增加放射敏感性疗法，丁酸盐增强基因疗法和放射治疗等等。
2.10  细胞因子基因治疗与化疗的联合
某些化疗药物如环磷酰胺、阿霉毒、丝裂霉素等在一定剂量范围内对免疫功能损害不大，甚至可以增强免疫功能。将某些细胞因子与化疗药物联合应用于治疗肿瘤可取得协同效果。细胞因子基因治疗与化疗联合应用值得深入研究。
肿瘤基因治疗已从理论走向实践。该法的有效性已在体外及动物实验中得到证实，部分临床试验亦取得了令人鼓舞的结果。同时我们也应看到，肿瘤的病因及发病机制复杂，基因结构和种类更为复杂，而人类对基因和肿瘤的知识了解还很少，基因治疗研究和应用也才刚刚起步。目前，肿瘤基因治疗可以成为肿瘤综合治疗的一部分，可能对提高化疗、放疗的敏感性，减少肿瘤的复发和转移起一定作用，甚至是明显的作用，但是还不能取代肿瘤治疗的手术、放疗、化疗。寻找更有效的治疗基因，研制高效和定向的基因转移载体、导入基因在人体内的调控方法等是基因治疗临床试验项目为肿瘤药物治疗带来无限美好的前景。