小鼠腹腔巨噬细胞的制备

yujian623

1.小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3分钟，取出小鼠，置于无菌纸上，腹面朝上；
2.用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜；
3.10ml注射器装上大号针头，注入6 ml Hanks液或PBS，用镊子提起腹膜，向腹腔中注入Hanks液，针尖朝上，避开肠和脂肪，回抽腹腔液，不同方向冲洗数次，吸出腹腔液；
4.细胞悬液离心200×g10分钟，用Hanks液洗一次，用RPMI1640－5%小牛血清悬起细胞，2×106细胞/ ml ；
5.细胞悬液置入培养瓶，37度培养2小时后，吸弃上清，用预热培养基洗二次，留下贴壁细胞；
6.含10 mM EDTA的PBS加入培养瓶，覆盖细胞，37度孵育20分钟，用吸管用力吹打下细胞，或用橡皮擦帚轻轻刮下细胞，即为腹腔巨噬细胞，纯度一般大于90%，每只小鼠平均可得2×106腹腔巨噬细胞。
注:
1.雌性小鼠6-8周最适用。雄性小鼠肠壁脂肪多。不利于腹腔液收集；
2.在冲洗过程中应小心，以免刺破血管或肠壁，血液流入腹腔液；
3.吸出的腹腔液应洗后再贴壁，否则有血浆膜形成，影响贴壁；
4.贴壁巨噬细胞分离有较多方法，如利多卡因孵育等，但大多不够理想，故细胞分离后应用台盼兰染色检测活力；
5.橡皮擦帚可自制，用自行车气门芯上的橡皮管套在预先折弯的滴管尖头上，灭菌后使用，较为实用；
6.炎性巨噬细胞的制备可用3%的脱水硫羟乙酸培养基2ml，注入小鼠腹腔，4天后同法由集腹腔细胞，每只小鼠腹腔细胞产量可以增加到3×107细胞左右。需指出的是炎性巨噬细胞的功能活性与正常腹腔巨噬细胞有很大差异。
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