一种全新的DNA甲基化研究方法 — Pyrosequencing技术

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DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。一般说来，DNA的甲基化会抑制基因的表达。DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的作用。

    CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上基因的启动子含有CpG岛。 CpG甲基化的研究在肿瘤的研究中有着非常主要的地位。通过基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达，从而引起相应基因沉默，去甲基化又可恢复其表达。DNA甲基化在生理情况下就参与了控制基因的时空表达，在肿瘤发生时，肿瘤细胞全基因组低甲基化是一个重要特征。肿瘤细胞基因组甲基化的程度与正常细胞相比仅为20-60% , 同时伴有局部区域基因的高甲基化,包括肿瘤抑制基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因、细胞周期调节基因、DNA修复基因、血管形成抑制基因等。但是目前研究手段的局限，限制了DNA甲基化的广泛研究。



    近年来，研究者不断探索定性及定量检测单个或多个甲基化位点的方法，但由于甲基化多态性区域存在的密度很高，所以对于延伸反应其引物的位置很难设计。Pyrosequencing技术作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。



    从原理上来看，Pyrosequencing是一种通过合成方法进行序列分析的方法，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。这项技术曾经被用作单核苷酸多态性（SNP）的基因型和单倍型的检测，以及细菌和病毒的鉴定和分型研究。这项技术的一个主要特点是在Pyrogarm™软件上显示的峰值高度来自于序列分析的原始数据，通过峰值的高度可以精确的检测混合DNA模板中等位基因的频率。



    目前甲基化研究方面，很多甲基化定量分析的报道采用亚硫酸氢盐处理甲基化样本，并用混合的PCR产物作为校正。其主要原理是：亚硫酸氢盐可以将没有甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而在适当的实验条件下甲基化的胞嘧啶保持不变。因而，用它处理样本后，再进行PCR扩增，甲基化的位点可以被当作一个C/T的SNP来处理，它的基因频率为0－100％。在此，我们给大家介绍一个研究人员使用Pyrosequencing技术分析并精确定量DNA甲基化水平的例子。



   研究者在一个Pyrosequencing反应中同时检测了6个甲基化位点。这种方法同样可以用于石蜡包埋的组织，并且具有较高的重复性和精确性。实验选择谷胱甘肽-S-转移酶π（GSTP1）转录启动位点的CpG岛进行检测。这些位点在正常前列腺组织中是非甲基化的，而在肿瘤样本中高甲基化。通过PCR扩增一个包含17个甲基化多态位点140bp的片段，并用4个测序引物研究其中15个位点（Table 1）。使用在线的SNP测序引物设计软件（Pyrosequencing AB）设计测序引物，其中一些甲基化多态性位点用最可能的碱基所代替，以减少计算的数量。再通过人工检测测序引物可能存在的错配。此外，同时在PSQ 96MA DNA分析仪上运行空白对照，扣除由测序引物、生物素标记的引物或是模板引起的背景。



    PCR引物设计完全与模板相匹配，不覆盖任何甲基化多态性区域。使用10ng亚硫酸氢盐转化的DNA样本或是10 fmol纯化的PCR产物，10 pmol 正向（5’-GTGATTTAGTATTGG-3’）和反向（5’-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3’）引物扩增GSTP1转录启动位点的基因片段，扩增片段长度为144bp。反应体系为60 mM Tris-SO4, pH 8.9, 18 mM (NH4)2SO4, 1 mM MgSO4, 200 μM dNTPs，以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶，终体积为50μL。PCR循环设置：首先在95℃下变性4分钟，然后在95℃ 30S，50℃ 45S以及72℃ 20S条件下重复50个循环，最后一步延伸步骤在72℃下4分钟，中止反应。PCR反应在Eppendorf的Mastercycler 96 Grandient上进行。



    PCR结束后，使用Pyrosequencing提供的试样预处理装置，用20－25μl连有生物素的PCR产物和streptavidin Sepharose HP beads（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）进行单链DNA模板的制备。然后，每个样本加入15pmol的测序引物，按照仪器使用说明，无需进一步的优化，将准备好的样本放置在PSQ 96MA仪器上，并使用SNP Reagent Kit（Pyrosequencing AB）进行检测（定量分析需要考虑4种PCR产物/样本PCR反应的差异）。



    数据分析采用PSQ 96MA软件的等位基因频率分析功能，通过计算基因频率来检测甲基化水平【甲基化%＝甲基化的峰值高度/（甲基化的峰值高度＋非甲基化的峰值高度）×100】。使用完全甲基化和完全未甲基化的人类DNA克隆得到的PCR产物的混合物（0％，25％，50％，75％和100％甲基化）检测15个位点用做校正曲线。所得曲线的线性相关性大于等于0.99，斜率约为1，并且所有位点的标准偏差约为1％（Figure 1A, position 10）。然而，如果校正在混合DNA clone模板PCR扩增之前进行，则校正不能显示线性趋势。使用三阶多项式拟合可以得到大于0.999的相关系数，并且每个样本和位点的标准偏差约为1％（Figure 1B, position 10）。Figure 1C显示位点5－10的Pyrogram软件分析结果。



这个例子显示了用Pyrosequencing方法进行甲基化检测的几个优点。六个甲基化多态性位点可以同时被检测，因此极大地降低了分析每个位点的消耗和人力。位点10显示了4到5倍峰值高度的T纯合链，并且校正如其他位点一样准确。Pyrosequencing技术可以作为给出绝对结果的、可以精确定量的检测平台，其校正曲线的形状只与PCR扩增相关。在这项研究中，曲线形状受由12％的序列差异引起的非甲基化的等位基因比甲基化的等位基因PCR扩增效率略高影响。氢键数量的不同（甲基化＝C-rich，非甲基化＝T-rich）极大的影响了PCR扩增过程的溶解和退火过程。这里需要强调控制PCR扩增效率的不同，或是对这种差异进行准确的校正对检测结果的准确性是非常必要的。