显微操作技术

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显微操作技术（micromanipulation technique）是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器（micromanipulator），这是一套能控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置，用来进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等，像是桃莉羊的产制就是运用细胞核移植技术达成的；而基因转殖（gene transfer）指的是将选殖之外源基因藉由导入体细胞并能稳定的嵌入宿主动物之生殖细胞染色体中之一门技术，基因转殖动物被定义为经由人为的方式将外源基因引入体内而引起基因改变之动物，并可将遗传特质传递至接续的每一世代中。产制基因转殖动物可利用基因显微注射（gene microinjection）、胚干细胞（embryonic stem cells, ES cells）、精子载体（sperm vector）、反转录病毒感染（retroviral vector infection）及体细胞核移置（somatic cell nuclear transfer）等方法达成，其中显微注射为目前应用最普遍之方法之一。显微注射法（microinjection）是利用管尖极细（0.1至0.5 μm）的玻璃微量注射针，将选殖之外源基因片段直接注射入原核期胚或是培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生之重排（rearrangement）、删除（deletion）、重复（duplication）或易位（translocation）等现象而使外源基因嵌入宿主之染色体内。这种显微注射术的程序，需有相当精密的显微操作设备，于制造长管尖时，需用微量吸管拉长器（micropipette puller），注射时需有固定管尖位置的微量操纵器。这种技术的长处为任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内。此法已成功的产制包括小鼠（mouse）、鱼、大鼠（rat）、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。以显微注射法转殖之外源基因较无长度上之限制，目前已证明数百kb之DNA片段均可成功产制出基因转殖动物。而其缺点为其设备经密昂贵、操作技术需要有相当时间的练习，及每次只能注射相当有限的细胞。



用于显微注射用之显微镜常使用具有位相差(phasecontrast)与微分干涉差(differential interference contrast)功能之倒立式显微镜(例如奥林巴斯的倒置显微镜IX71或IX81)，倒立式显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，一般正立显微镜之物镜在载物台之上，照明系统在下，而倒立式显微镜之物镜在下与而照明系统在载物台之上，倒立式显微镜之优点为接物镜与目镜间之工作距离较长，可直接将培养皿之置显微镜操作台上进行显微注射等工作。传统之一般普通光学显微镜无法直接观察未经染色之透明的活细胞，为了能让显微注射技术观察与操作透明的活细胞样品，显微镜须使用具有位相差与微分干涉差功能之倒立式显微镜。位相差显微镜是由P．Zernike于1932年发明，并因此获得1953年诺贝尔物理奖，这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的透明标本和活细胞，位相差显微镜的基本原理是利用透明细胞检体内部折射率各不相同，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，得到明暗对比的效果，使的透明活细胞各种结构内部细节在亮背景视野中变得清晰可见，位相差显微镜之基本构造是利用位相差聚光镜及内部位相环所构成的环状光圈，光通过聚光镜后，产生中空光锥，并在光线穿过检体后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再经过物镜内的光延迟位环板而成增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下提高反差。虽然相差显微镜可以在透明的细胞样品提供清析的观察图像，但是一般位相差显微镜的缺点是会有「光晕」现象的产生，因而导致观察的景深受限制，无法用以观察较厚的样品，较厚的细胞团区域在一般位相差显微镜下的清稀度十分糟糕，而且边缘常产生晕轮效果，如果观察样品中有超过85%以上的区域为较厚细胞时，这个问题将非常严重，然而显微注射用之样品如受精卵细胞或细胞团均具有一定厚度，造成细胞结构和边缘无法清楚可见，因此显微注射用的显微镜必须要能克服厚样品的问题。




为解决活动样品和厚样品带有「光晕」的观察问题，1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜（differential interference contrast microscope）。Nomarski 微分干涉差显微镜之优点是能显示结构的三维立体投影影像，与传统位相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强，产生类似于浮雕的效果。微分干涉差显微镜技术设计比相差显微镜要复杂得多，Nomarski DIC利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器（polarizer）、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器（analyzer）。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了二个楔形单轴的晶体,如石英,以光轴互相交错的方式互相接合，称为Wollaston棱镜或Nomarski棱镜，即DIC棱镜，此棱镜可将每一光线分离成为二条偏振互相垂直的两束光（x和y），二者成一小夹角，聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波合并成一束，这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器，在光束形成目镜DIC影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角，检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少，当光程差值为0时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值，于是在灰色的背景上，标本结构便呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态，观察者可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，改变光程差可以改变影像的亮度。而调节DIC滑行器则可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，产生了类似大理石上的浮雕感觉。 DIC显微镜使细胞的内部结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，因此适合应用于显微操作技术。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常需要在这种显微镜下进行。

虽然Nomarski微分干涉技术可以对付一些细胞团或者组织等较厚的样品，但它非常昂贵，并且仅仅只能应用在玻璃底的培养皿中，无法直接在广为研究人员进行细胞培养操作之一般塑料材质的培养皿产生浮雕效果，此外这种技术对于显微操作技术的所使用的样品而言，景深还是稍嫌不足，因此在应用上遇到不少问题。有鉴于此，一些其它的可以用于观察厚样品的微分干涉技术也逐渐被开发出来，  

例如OLYMPUS奥林巴斯公司就推出了自己的浮雕相衬（RC）装置奥林巴斯浮雕相衬系统能够产生高反差的3D 图像，类似于DIC效果，可用于塑料器皿中的样品。浮雕相衬用于细胞受精，使细胞核膜更容易看到和穿刺。 适应于所有类型的细胞,组织(无论活体,染色,未染色),晶体表面细节,透明聚合物,玻璃和其它类似材料,尤其适应于显微操作实验.

目前最常用来生产基因转殖动物的方式为：直接把重组过的 DNA 注入授精卵的原核 (pronuleus) 中，将从胚胎提供者的输卵管中取得的授精卵移到倒立式显微镜上的微量注射台上，然后利用固定吸量管 (holding pipette) 固定住，之后注射针则依序穿过 zona pellucida，oocyte membrance及male pronuleus membrane后，将 DNA 注入，注入时可以见到原核膨大。以小鼠受精卵雄原核之显微注射为例，显微注射所使用的受精卵之固定吸管（holding pipette）及注射针（injection needle）之制备困难，除影响操作时间外，亦是影响基因转殖效率及基因注入后之胚存活及基因转殖成功与否极其重要的因子。固定吸管之内、外径分别为30、80 μm较为适当的。显微注射针自针尖起20 μm处之外径为4 μm时，可获得良好的转殖效率。固定吸管之内径如太小，会导致吸力不足，对受精卵操控不易，如太大，则受精卵易受伤害，影响胚之存活率。显微注射针尖如太粗，则导致插入透明带及原核之阻力增加，且DNA流量过多，受精卵易于裂解，太细则致针内DNA流出速率过慢，且易阻塞，而使DNA无法顺利流入原核内，影响注射效率。因此进行受精卵雄原核之显微注射时，如何制备适用之固定受精卵之吸管及显微注射针是关乎基因转殖效率极其重要的因素。

基因转殖动物（transgenic animal）于目前生物及医学研究方面之应用极为广泛，基因转殖小鼠一直是研究外源基因构筑型态、染色体嵌插、转殖基因表现及调节之最佳模式，也是建立基因转殖技术最好的工具，尤其是在产制基因转殖家畜之前，如能先以小鼠进行预备试验是求事半功倍不可或缺之过程。基因转殖动物应用的领域可以包括研究基因的活动对致癌病毒与癌细胞的生长的影响、基因的活动与免疫细胞间的交互作用与调控的机制、研究基因对于生长的调控机制，以及生物学与遗传学的机制，也被应用于以人类细胞作为组织及器官移植的发展方面，如基因参与体细胞、胚胎干细胞及存在各个组织的干细胞的体外诱导分化研究等等。基因转殖动物除用于一般基础研究外，对于制造具治疗效果的蛋白质、器官移植、疫苗、毒理实验、动物品种改良及水产养殖等均有很大的贡献。虽然截至目前为止，基因转殖之研发已有若干良好的成果，但尚有若干问题待克服，所以基因转殖技术之应用与发展将是无可限量的。显微操作系统应用范围和广，例如IVF，ISCI，做小鼠，牛，猪等胚胎移植，细胞核移植等，还有脑片膜片钳PATCH CLAMP和单细胞膜片钳实验都需要显微操作系统的支持，还有在免疫学和分子病理学研究中最长用的显微切割技术，它也需要显微操作系统的帮助。总之一句话，显微操作系统的应用范围很广泛，不知道斑竹需要关于显微操作哪方面的资料。

先介绍一编显微操作系统关于牛胚胎移植的资料，需要其它资料请和我联系。


胚胎移植又称受精卵移植，就是将1头母畜(供体)的受精卵移植到另一头母畜(受体)的子宫内，使之正常发育，俗称“借腹怀胎”。
　　(一)胚胎移植的意义
　　1．充分发挥优良母牛的繁殖潜力 一般情况下，1头优良成年母牛一年只能繁殖1头犊牛，应用胚胎移植技术，一年可得到几头至几十头优良母牛的后代，大大加速了良种牛群的建立和扩大。
　　2．诱发肉牛产双胎 对发情的母牛配种后再移植一个胚胎到排卵对侧子宫角内。这样配种后未受孕的母牛可能因接受移植的胚胎而妊娠，而配种后受母牛则由于增加了一个移植的胚胎而怀双胎。另外，也可对未配种的母牛在两侧子宫角各移植一个胚胎而怀双胎，从而提高生产效率。
　　3．应用胚胎移植还可以减少肉用繁殖母牛的饲养头数，可以代替种畜的引进和保存品种资源等。
　　(二)胚胎移植的生理基础
　　1．母牛发情后生殖器官的孕向发育 在发情后的最初一段时期(周期性黄体期)，不论是否已受精，母牛生殖系统均处于受精后的生理状态之下，在生理现象上，妊娠与未孕并无区别。所以，发情后的母牛生殖器官的孕向变化，是进行胚胎移植时使不配种的受体母牛可以接受胚胎，并为胚胎发育提供各种条件的主要生理学依据。
　　2．早期胚胎的游离状态 胚胎在发育早期有相当一段时间(附植之前)是独立存在的，它的发育基本上靠本身贮存的养分，还未和子宫建立实质性联系。所以，在离开活体情况下，在短时间内可以存活。当放回与供体相同的环境中，即可继续发育。
　　3.胚胎移植不存在免疫问题 受体母畜的生殖道(子宫和输卵管)对于具有外来抗原物质的胚胎和胎膜组织，一般来说，在同一物种之内，并没有免疫排斥现象，这一点对胚胎由一个体移植给另一个体后而继续发育极为有利。
　　4．胚胎和受体的联系 移植的胚胎，在一定时期会和受体子宫内膜建立生理上和组织上的联系，从而保证了以后的正常发育。此外，受体并不会对胚胎产生遗传上的影响，不会影响胚胎固有的优良性状。
　　(三)胚胎移植的操作原则
　　1．胚胎移植前后所处环境的一致性 即胚胎移植后的生活环境和胚胎的发育阶段相适应。包括生理上的一致性(即供体和受体在发情时间上的一致性)和解剖位上的一致性(即移植后的胚胎与移植前所处的空间环境的相似性)以及种属一致性(即供体与受体应届同一物种，但并不排除种间移植成功的可能性)。
　　2．胚胎收集期限 胚胎收集和移植的期限(胚胎的日龄)不能超过周期黄体的寿命，最迟要在周期黄体退化之前数日进行移植。通常是在供体发情配种后3一s日内收集和移植胚胎。
　　3.在全部操作过程中，胚胎不应受到任何不良因素(物理的、化学的、微生物的)的影响而危及生命力。移植的胚胎必须经鉴定并认为是发育正常者。
　　(四)胚胎移植的基本程序 胚胎移植的基本程序包括供体超排与授精，受体同期发情处理、采卵、检卵和移植。关于超排和同期发情处理在前面已有叙述，本书仅介绍采卵、检卵和移植。
　　1．胚胎回收(采卵) 从供体收集胚胎的方法肴手术法和非手术法两种。
　　(1)手术法 按外科剖腹术的要求进行术前准备。手术部位位于右肋部或腹下乳房至脐部之间的腹白线处切开。伸进食指找到输卵管和子宫角，引出切口外。如果在输精后3—4天期间釆卵，受精卵还未移行到子宫角，可采用输卵管冲卵的方法。将一直径2毫米，长约10厘米的聚乙烯管从输卵管腹腔口插入2—3厘米，另用注射器吸取5—10毫升30℃左右冲卵液，连接7号针头，在子宫角前端刺人，再送人输卵管峡部，注入冲卵液。穿刺针头应磨钝，以免损伤子宫内膜；冲洗速度应缓慢，使冲洗液连续地流出。如果在输精后5天收胚，还必须做子宫角冲胚。即用10一15毫升冲卵液由宫管结合部子宫角上部向子宫角分叉部冲洗。为了使冲卵液不致由输卵管流出，可用止血钳夹住宫管结合部附近的输卵管，在于宫角分叉 部插入回收针，并用肠钳夹住子宫与回收针后部，固定回收针，并使冲卵液不致流人子宫体内。
　　(2)非手术法 非手术采卵一般在输精后5—7天进行。可采用二路导管的冲卵器。二路式冲卵器是由带气囊的导管与单路管组成。导管中一路为气囊充气用，另一路为注入和回收冲卵液用。
　　导管中插1根金属通杆以增加硬度，使之易于通过子宫颈。一般用直肠把握法将导管经子宫颈导人子宫角。为防止子宫颈紧缩及母牛努责不安，采卵时可在腰荐或尾椎间隙用2％的普鲁卡因或利多卡因5—10毫升进行硬膜外腔麻醉。操作前洗净外阴部并用酒精消毒。为防止导管在阴道内被污染，可用外套膜(有商品出售)套在导管外，当导管进人子宫颈后，扯去套膜。将导管插入一侧子宫角后，从充管向气囊充气，使气囊胀起并触及子宫角内壁，以防止冲卵液倒流。然后抽出通杆，经单路管向子宫角注入冲卵液，每次15—50毫升，冲洗5—6次，并将冲卵液收集在漏斗形容器中。为更多地回收冲卵液，可在直肠内轻轻按摩子宫角。用同样方法冲洗对侧子宫角。
　　冲卵液多数为组织培养液，如林格氏液、杜氏磷酸盐缓冲液(PE)、布林斯特氏液(BMOC-3)和TCM—199等。常用的为杜氏磷酸盐缓冲液，加入0．4％的牛血清白蛋白或1％一10％犊牛血清。
　　冲卵液温度使用时应为35—37℃，每毫升要加入青霉素1000国际单位，链霉素500—1000微克，以防止生殖道感染。
　　2．胚胎检查
　　(1)检卵 将收集的冲卵液于37℃温箱内静置10一15分钟。胚胎沉底后，移去上层液。取底部少量液体移至平皿内，静置后，在实体显微镜下先在低倍(10一20倍)下检查胚胎数量，然后在较大倍数(50—100倍)下观察胚胎质量。
　　(2)吸卵 吸卵是为了移取、清洗、处理胚胎，要求目标准确，速度快，带液量少，无丢失。吸卵可用1毫升的注射器装上特别的吸头进行，也可使用自制的吸卵管。
　　(3)胚胎质量鉴定 正常发育的胚胎，其中细胞(卵裂球)外形整齐，大小一致，分布均匀，外膜完整。无卵裂现象(未受精)和异常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能用于移植。
　　3．胚胎移植
　　(1)手术移植 先将受体母牛作好术前准备。已配种母牛，在右肋部切口，找到非排卵侧子宫角，再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宫角前端，注人胚胎；未配母牛在每侧子宫角各注入一个胚胎；然后将子宫复位，缝合切口。
　　(2)非手术移植 非手术移植一般在发情后第六至第九天(即胚泡阶段)进行，过早移植会影响受胎率。在非手术移植中采用胚胎移植枪和0．25毫升细管移植的效果较好。将细管截去适量，吸入少许保存液，吸一个气泡，然后吸人含胚胎的少许保存液，吸人一个气泡，最后再吸取少许保存液。将装有胚胎的吸管装入移植枪内，通过子宫颈插入子宫角深部，注入胚胎。非手术移植要严格遵守无菌操作规程，以防生殖道感染。