HIV病毒载量测定及其质量控制

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1987年John首次提出病毒载量（viral load）的概念，指出它代表的是病毒的负荷，即体内复制的病毒的数量。实际上，体内复制的病毒的数量是不能直接测量的，一般用血浆中HIV RNA的拷贝数代表HIV的病毒载量。HIV病毒载量与疾病进展速率和预后有强相关关系，它比CD4+T细胞计数更能有效地反映抗病毒治疗的效果，病毒载量测定广泛用于评估HIV感染的进程，确定抗病毒治疗的方案以及监测抗病毒治疗的效果。与血清学检测方法相比，HIV病毒载量测定的方法学十分复杂，影响因素多，对实验室条件和技术水平的要求高，更容易出现错误和误差。因此，理解各种检测方法的原理和特点，了解各种影响因素的来源及其作用的程度，采取全面的质量管理措施对于得出正确的结果十分重要。
一 病毒载量测定的方法学
1 HIV-1 Quantiplex ( bDNA ) 实验：
是分支DNA杂交实验。血浆HIV-1 RNA通过逐级放大的信号定量而不是靶核酸的扩增，不需要RNA提取和纯化以及PCR扩增。主要步骤是：首先离心浓缩病毒颗粒，然后用去垢剂和蛋白酶K裂解毒粒，释放病毒RNA。裂解产物与两组寡核苷酸探针一起孵育，第一组捕获病毒RNA、与HIV-1 pol基因的保守区杂交，同时与结合在微孔板上的寡核苷酸探针杂交。第二组寡核苷酸探针进行信号放大，它包括4种成分：与靶RNA和预放大寡核苷酸均具有同源性的寡核苷酸探针、预放大寡核苷酸探针、放大寡核苷酸探针和与碱性磷酸酶结合的寡核苷酸探针。每一个组分都通过杂交与下一个位点结合，按照这种方式，信号被逐级放大而靶RNA并没有复制。用碱性磷酸酶特异的底物通过化学发光进行检测，发光强度与结合的核酸量成正比，HIV-1 RNA的绝对量由在同一板上反应的外标曲线来确定。
信号扩增的主要优点是避免了提取和扩增目标核酸可能带来的固有的错误，试验的重复性相当好，特别是在动态范围的下限。由于并没有PCR反应，不会受能够抑制Taq DNA聚合酶的血浆物质和抗凝剂 （例如肝素）的影响。实验使用针对HIV－1 pol基因多个保守区的80多条寡核苷酸探针，能够与HIV-1 M群的A—F亚型结合，最大限度减少了病毒基因变异对实验准确性的影响。
HIV-1 Quantiplex ( bDNA ) 实验已经被美国FDA批准。3.0版实验方法对探针设计和稀释液配方作了较大改进，目的是尽可能减少非特异杂交、增强信号的强度，从而降低背景信号、提高敏感性。3.0版也提高了扩增容量，每块板能做84份标本。除了标准方法以外，还发展了超敏感方法，检测的动态范围可以达到75－500000cp/ml。如果先用标准方法，有44％标本在检测下限以下，需要用超敏法重复，如果先用超敏方法，有17％的标本在检测上限以上，需要用标准方法进行重复，因此选择试验方法时最好了解病人的情况，包括以前检测的结果和抗病毒治疗的历史。
2 Amplicor HIV-1 Monitor实验
是基于目标HIV-1 RNA的cDNA的多聚酶链反应。用异硫氰酸胍法提取病毒RNA，用异丙醇沉淀核酸，使用热稳定重组的、具有逆转录酶和DNA聚合酶活性的rTth DNA多聚酶，逆转录和PCR一步完成。在生物素标记的HIV gag区引物、rTth DNA多聚酶、脱氧三磷酸核苷和合适的缓冲液成分存在的条件下，cDNA被扩增到非常高的拷贝数。将扩增产物变性，单链DNA与微孔板上包被的HIV特异性寡核苷酸探针结合、然后加过氧化物酶标记的亲和素，与生物素标记的扩增产物结合，在加入HRP特异的产色底物以后就可以确定扩增产物的数量。实验使用已知浓度的内部定量标准，在提取RNA之前加到每份标本中，既可以定量标本中的HIV RNA，又可以弥补血浆中存在的影响提取和扩增的抑制因子。内标由体外转录的RNA组成，与靶扩增片段大小相同，并具有相同的HIV-1 gag区引物结合位点，产生的扩增产物同样也被捕获在微孔板上，最后用酶联检测系统读出光密度。
Amplicor HIV-1 Monitor是被美国FDA批准的HIV-1 RNA定量实验，1.0版能够定量400-750000拷贝/毫升的HIV RNA，需要0.2毫升血浆。超敏试验能够检测更低水平的HIV RNA，改进的方法包括增加标本用量（0.5毫升血浆）、超速离心浓缩病毒颗粒、减少重悬液体的体积等等，这使得检测的敏感性提高到50cp/ml。但是与此同时检测的上限也下降了（7.5万）。因此将二个版本的程序结合起来，检测的动态范围就是50-750000 cp/ml。但是如果没有选用合适的方法，一份标本就需要检测二次，因此最好事先了解病人的情况，再决定使用哪一种方法。比如抗病毒治疗的历史、以前的病毒载量等等。
在共同的动态范围内，标准的和超敏的方法测定HIV RNA浓度具有很好的相关性。1.5版实验也已经推出，在美国只用于研究。1.5版对M群内所有的亚型都可以同等的扩增，在引物、热循环条件和缓冲液成分上有些不同。1.0版使用的引物是SK642和SK431，扩增片段是142bp的HIV-1gag序列。1.5版的引物也是在gag区域，但是上游引物变为SK145，两个碱基的变化增加了与M群病毒的同源性。下游引物变为SKCC1B，向3，，端保守区略微移动，与SK431相比有一个碱基的变化。1.5版的退火温度降低、缓冲液成分进一步增加了对HIV不同株的扩增。为了适应扩增长度的增加，内部定量标准（qs）增加了20个核苷,但是与1.0版使用相同的捕获探针，其他与1.0版完全相同。
Amplicor HIV-1 Monitor方法的优点是有内部定量标准，被临床和包括美国NIH ACTG实验室在内的大批实验室广泛接受。试验完成需要1天时间，可以同时检测大量标本。由于使用的是PCR扩增的方法，受PCR固有的一些因素的影响，包括污染的危险、一些血浆成分和抗凝剂可能影响酶活性等等。这可以通过改进试验操作加以克服，包括采用固定的工作流程、使用阳性和阴性对照以及内部定量标准等等。
3 NucliSens HIV-1实验
是使用NASBA技术的靶扩增试验。NASBA技术选择性地直接扩增RNA而没有PCR步骤，用2个寡核苷酸引物、3个酶、三磷酸脱氧核苷和合适的缓冲液进行一步夹心杂交。首先用异硫氰酸胍和氧化硅颗粒提取高纯度RNA，RNA通过重复的合成和转录双链DNA中间体得到扩增。在AMV-RT的作用下，HIV-1gag区的引物P1介导由标本RNA合成cDNA，RNA链被RNAse降解。引物P2结合启动第二条DNA链合成，反义RNA通过T7多聚酶启动双链DNA合成，这个循环不断重复，使得靶RNA在等温条件下大量扩增100万到1000万倍，然后直接用化学发光法确定核酸量，通过HIV特异的gag和pol区的3个内标同时扩增而达到定量目的。它具有高度敏感性和广阔的动态范围。
最近NucliSens HIV-1定量实验有了较大改进，将NASBA核酸扩增技术与实时(real-time)检测技术结合起来,能够对检测进行实时监控。结果表达方式由每毫升标本的拷贝数（cp/ml）改变为每毫升国际单位（IU/ml）。这个实验的优点是使用的样品量较少（标准是1.0ml，0.01-2.0ml均可）、有广泛的动态范围（50-3000000IU/ml）、反应快（2小时可以检测48份标本）、特异性可以达到99.7%（95％的可信限是98.5%-100%）、精密性1000－3000000IU/ml是0.12log、≤1000IU/ml是0.28log。反应在一只管子内完成、不需要温度循环、提取的RNA相对较纯、不受抑制PCR扩增的干扰物质影响等等。除血浆以外，这个方法还可以用来测定组织中的病毒载量。
4 不同方法的比较
三种测定病毒载量的方法都有各自的源于方法本身的优势和不足（表1）。大量配对比较实验表明，在允许的动态范围内三种方法测定的结果有高度相关性，也都具有较高的敏感性和重复性，抗病毒治疗以后血浆病毒载量的变化用三种方法测量的结果也是相似的。但是三种方法测定的绝对值却不能直接比较，不同方法间的变异可以达到0.08-0.26log （1.2-1.9倍）。在澳大利亚进行的一项评估显示，Amplicor HIV-1 Monitor 1.0和HIV-1 Quantiplex 2.0的变异系数分别是53-87%和22-31%，Amplicor HIV-1 Monitor 1.5和HIV-1 Quantiplex 3.0的变异系数分别是82-86%和16-23%，这些结果提示即使使用最新版本的检测试剂，不同的实验室和不同方法之间仍然有很大的差别，因此检测病毒载量必须始终在相同的实验使用相同的方法。
表1 三种病毒载量测定方法的比较
方 法
Quantiplex HIV-1 RNA
Amplicor HIV-1 Monitor
NucliSens HIV-1 QT

原 理
bDNA
RT-PCR
NASBA

检测范围
50-500000cp/ml
400-750000cp/ml 50-75000cp/ml（超敏） 50-3000000cp/ml

检测亚型
A-G
A-G
A-G

标本量
1ml
0.2ml
0.5ml（超敏）
10μl-2ml

优 点
FDA批准，不需要RNA提取和纯化，需时间短、出结果快 FDA批准
应用广泛
可以检测组织和体液中的病毒载量，具有最大的检测范围。



三种病毒载量测定方法都具有高度的特异性，未感染的标本几乎都可以得出100%的阴性结果。但是在有些情况下，由于污染或非特异交叉也可能出现假阳性结果。因此，没有一种病毒载量测定方法被FDA批准用来做HIV感染的诊断，最可靠的诊断方法还是血清学方法。
5 病毒载量测定结果的国际单位
由于不同病毒载量测定结果存在较大变异，为了增强可比性、便于不同实验室和不同方法的比较，WHO组织了10个国家26个实验室的协作研究，利用人工制备的三种标准品建立了病毒载量测定结果的国际标准。本次研究的结果显示，含量为100000IU/ml的标本用bDNA、Monitor和NucliSens三种方法检测的结果分别是4.61log(4.51log-4.69log)、4.71log(4.37log-5.16log)和 5.01log (4.94log-5.12log)，也就是国际单位（IU）与拷贝数（cp/ml）的换算大约是1：0.92～1:1.00。

二、影响病毒载量测定结果的因素
1 标本类型
血浆和血清标本都可用来测定病毒载量，用三种测定方法进行比较都发现血清和血浆测定的结果有高度相关性。但是血清的检测结果大约是血浆的50%（ 30-80% ），可能是因为血液凝固的过程中HIV颗粒被包裹在纤维蛋白网络中，导致血清中病毒的浓度下降。因此，测定病毒载量应该首选血浆标本，血浆也是临床使用的唯一标本。血清标本对于研究也是可以接受的，重要的是每位病人使用的标本类型应始终保持一致。
2 抗凝剂
抗凝剂能够显著影响测定的结果。肝素钠处理的血浆不适合做Amplicor HIV-1 Monitor试验，因为肝素是PCR反应的一个潜在的抑制剂。如果必须用RT-PCR方法测量肝素处理的血浆，可以向标本中加入肝素酶以分解肝素。另外，肝素处理的血浆中病毒颗粒降解的速率显著高于EDTA钠盐和枸橼酸钠处理的血浆，一般情况下不同抗凝剂处理的血液6小时之内HIV RNA的降解速率分别是1.8%/小时（EDTA）、3.3%/小时（枸橼酸钠）和5.0%/小时（肝素）。在血液处理方法相同的条件下，用EDTA钠盐抗凝的血浆结果显著优于枸橼酸钠和肝素，因此EDTA钠盐是首选的抗凝剂。
3 标本处理时间和温度
HIV-1在体内进行快速转换，平均半衰期是大约6个小时。HIV-1在体外未处理的全血中也快速降解，全血中HIV RNA的降解速率在6小时之内平均是9%（0.04log）,最大的降解速率是在采血以后6-8小时，采血以后30小时内可能减少0.5log。因此为了减少病毒颗粒降解对检测的影响，应该在采血以后6小时之内分离血球和血浆，如果做不到就应该使用血浆分离管，立即离心4℃存放，需要保存30小时以上就应该放在-70℃。
温度对HIV RNA的影响不显著。-70℃～室温反复冻融3次，HIV RNA变化的幅度小于0.2log。-70℃保存5个月，HIV RNA减少0.3-0.5log，-70℃保存12个月，HIV RNA减少一般不超过0.4log。血浆在室温或4 ℃保存3天，HIV RNA减少不超过0.5log。
三、病毒载量测定结果的分析和解释
分析一个病人不同时间病毒载量测定的结果时，首先要考虑测定结果的变化是真实的生物学改变还是方法本身的变异或误差。
大量比较研究显示病毒载量测定商品化试剂盒的精密度是大约0.2-0.5log（1.7-3倍），在不同的检测动态区域有所不同，相对来说在低病毒载量区域的变异更大，如某实验室测定高滴度样品（4.0-5.7log）的标准差是0.20log，测定低滴度样品（2.6-3.9log）的标准差达到0.22log，临床稳性的病人病毒载量每日的变化大约是0.4log（2.5倍）。因此病毒载量的变化超过0.5log（大约是3倍）就超过了实验和每日的正常变化，应被视为有生物学意义的变化，而0.5log以内的变化就很难与随机的变异相区分。特别需要注意的是在接近检测下限的时候，实验的变异对于解释病毒载量变化的意义有更大的影响。例如，病毒载量从50cp/ml增加到150cp/ml，虽然变化的幅度达到0.5log，但真正反映的可能是实验的变异而不是抗病毒治疗的失败，因此对于接近检测下限的测定结果需要进行认真分析。
四、病毒载量测定的质量管理
核酸检测的显著优点是高度敏感性，这反过来增加了污染和取样误差的危险，方法本身的复杂性也增加了系统和随机误差。试剂昂贵的价格限制了技术人员对方法的熟悉、对试剂的评价和对仪器的研究，这些都增加了出现错误和误差的危险（表2）。要认真分析这些因素，确定重点监控对象，同时应避免过份纠缠没有临床意义的细小误差。
艾滋病检测实验室通用的质量保证、质量控制和质量评价原理和方法适用于HIV病毒载量检测。
1 质量保证
质量保证指从接收样品到发出报告的整个过程中，为确保最终结果的正确性所采取的全部措施。质量保证是质量管理的基础，包括质量控制和其他所有为确保检测质量所采取的一切活动。病毒载量测定的质量保证可采取与其他检测相同的基本措施，在这个基础上，增加其他一些必要的步骤
2 质量控制
制定和实施质量控制计划之前首先要对使用的方法和系统进行深入的了解，包括方法的检出限、偏性、误差被接受和拒绝的统计学水平。还应对方法的线性进行检查，在整个动力学过程中始终保持线性的方法比非线性方法需要的对照少，也要考虑不同测定值的临床意义。掌握这些参数有助于制定切合实际的质量控制方案，监视和解决实验中出现的问题，增加试验的可信度。
质量控制包括3个部分：对照（control）、程序（Procedure）和规则（rules）。
对照是已知浓度的、与待测物同质的稳定物质，用来监视实验的重复性和稳定性。定性方法只有一个决定点，也就是区分阳性与阴性的临界值，只需在临界值的二侧各设立一个对照。定量方法设立对照比较复杂，需要在检测范围内及其上、下限设立对照，定量核酸检测需要覆盖5个log的动态范围，线性方法至少需要在这个范围内设立2个对照，非线性方法至少需要3个对照。
将对照与待测样品一同检测，可以用传统的方法绘制质量控制图，最好将测定值进行对数转换而不用绝对数计算，这样能够使变异系数（CV%）减小，但这要求病人的测定数据也用对数形式报告的，也就是说要与临床使用的报告形式一致。质量控制的规则与其他检测相同，也是±2S.D和±3S.D规则，即测定值超出平均数±2S.D范围警告，超出平均数±3S.D拒绝。也可参考厂商提供的质控规则。
3 质量评价
可以用已知HIV RNA浓度的血浆样品进行外部质量评价。对质量评价样品的要求是：（1）覆盖检测的动态范围，一般要求5个log。（2）重复测定同一份样品考察精密度。（3）包含HIV-1不同亚型的样品。