淋巴细胞转化试验技术:形态学检查法

yujian623

（一）材料与试剂
1．小牛血清 取新生的小牛，无菌采血，分离血清。于56℃灭活后分装小瓶，放入低温冰箱保存。
2．双抗 配成每毫升含青霉素1.00×104U，链霉素1.00×104U的混合液。存放于-20℃。
3．6%NaHCO3水溶液
4．肝素 以灭菌生理盐水配成500U/ml，115℃灭菌30min，4℃保存备用。
5．PHA 以灭菌生理盐水配成1 000礸/ml，经G-5漏斗过滤，分装小瓶，保存于-20℃备用。
6．姬姆萨染液、瑞氏染液。
7．pH6.4磷酸盐缓冲液：
KH2PO4  6.62g
Na2HPO4  2.56g
H2O    1 000.00ml
8．营养液 采用199营养液或RPMI－1640营养液，配法如下：
  199营养液    79.00ml
  小牛血清     20.00ml
  “双抗”     1.00ml
依次加入后，再用高压灭菌的6% NaHCO3液调pH至7.2～7.3，分装小瓶，每 瓶0.2ml。
（二）操作方法
1． 于培养瓶内加0.2ml马血，对照组与试验组各做2瓶，试验组均加PHA 30礸；
2．37℃培养72h，每天轻摇1~2次；
3．取出培养瓶，摇散血块，倒入离心管，3 000r/min离心10min，去上清液；
4．用血球泥制备推片，晾干；
5．以瑞氏染液染2min~3min，加等量缓冲液，混匀继续染3min，蒸馏水冲洗后再用姬姆萨染液染2min~3min。加等量缓冲染液感作7min~8min，馏水冲洗，晾干；
6．镜检，观察，计数。
（三）结果判定  
在油镜下，观察淋巴细胞的形态变化（见表21-1），以头、体、尾三部分计算，至少计数100个或200个淋巴细胞，然后按公式计算出淋巴细胞形态转化率。
成年马的淋巴细胞转化率，根据原兽医大学20例检查，平均为35.58%。

不加PHA的对照组一般不转化或转化率只在1%左右。