细胞的原位杂交技术

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原位杂交(ISH)是一种可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA的技术，此方法原理是由DNA或RNA的序列与互补的标记单链DNA/RNA探针结合形成标记的双链杂交分子，本技术可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性，定量及定位分析。在细胞分化调节、基因定位、肿瘤遗传学、分子病理学、病毒学等领域得到广泛应用。经典的原位杂交技术包括载玻片处理，组织细胞的固定，探针的制备或选购，原位杂交，洗涤以及检测，其中探针制备技术不属于本章专业技术，故不作具体评叙，略交待制备使用原则。本章节主要介绍培养细胞的原位杂交技术。
一、探针的制备原则和选择
探针为RNA或双链、单链DNA，双链探针较单链探针有很多缺点，探针必须变性、复性，降低了探针杂交效率，双链探针在溶液中形成长的链状结构倾向，限制了它的组织穿透能力。适用于基因组DNA杂交。由于原位杂交的探针将与高密度的细胞融合，因此，需要减短探针的长度或增加探针的浓度，但是过高浓度的探针往往会增加非特异性结合，因此每种探针应选择适当的浓度。
探针的获得常采用随机引物延伸法的PCR合成和扩增，可获大量的DNA探针，或利用带有噬菌体强启动子多克隆位点的质粒载体来合成RMA探针，也可利用质粒菌扩增质粒，经酶切后纯化的基因片断，均可以获得制备探针原料。这些探针可以用同位素标记，也可以用非同位素标记，即光敏生物标记或地高辛配基标记于脱氧脲嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成的地高辛-dUTP，可通过随机引物或缺口平移法与探针的核酸分子相连，构成地高辛一配基标记的核酸探针。比探针可用抗地高辛抗体偶联酶或荧光素通过松体结合和底物显色或产生荧光来检测。
这些探针基本均有市售，无需自行制备，只要根据说明书使用即可。
二、载玻片和盖玻片预处理
为了防止探针的非特异贴附而保证细胞粘附而需处理：
1、用于检测RNA的载玻片的处理
(1)用0.1mol/L HCL洗载玻片20分钟，再用无水乙醇洗数次使其干燥。
(2)在下列溶液中，65℃处理2小时
  3×SSC  0.02%FicoLL400 0.02%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)。
(3)固定在乙醇/乙酸(3:1 V/V)20分钟，180℃烘烤2小时。
2、用于检测DNA的载玻片的处理
以TESPA(three-amino-propyl-triethoxy-silane)涂载玻片。
3、对于盖玻片：于0.1mol/L HCL中浸泡20分钟，用无水乙醇洗，干燥后用二甲基氯化硅硅化，180℃烤2小时。
三、组织细胞固定
理想的细胞固定过程应该保护细胞形态，同时确保目的基因DNA或RNA序列暴露。对于RNA-RNA原位杂交有效的固定剂是4%多聚甲醛和PLPD（磷酸缓冲液PBS、赖氨酸、过碘酸盐及重酪酸盐）。
1、涂片细胞原位杂交固定
(1)用含有0.02%EDTA的PBS洗涤细胞，于0.1%胰蛋白酶消化，收获细胞计数，涂载玻片上。
(2)若检测RNA，固定于4%多聚甲醛pH7.0，在4℃下放60分钟，PBS洗5分钟，系列乙醇脱水干燥，-20℃保存。
(3)若检测DNA，固定在4%多聚甲醛16～24小时，0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分钟，浸泡在下述溶液中2×5分钟：
0.25%(v/v)Tritonx-100；0.25%(v/v)Nonidet P40；0.1mol/L Tris-HCL pH7.4；再用0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分钟。
(4)在100μg/ml蛋白酶K，50mmol/L Tris-HCL PH8.0，5mmol/L EDTA溶液中，37℃处理10分钟，再用含有甘氨酸的0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分钟。
(5)在20%(v/v)乙酸中40℃处理15分钟，0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分钟。
注意：对于DNA-DNA原位杂交多聚甲醛或福尔马林均可，但对于地高辛检测法必须用4%多聚甲醛，固定至少16小时，而且用蛋白酶K处理，这样可明显减少背景染色。