细胞因子与实体瘤的免疫基因治疗

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尽管我们对癌症生物学和癌症治疗的许多方面有了最新的理解，
癌症治疗的成功率为仍然微乎其微。癌症的免疫治疗可能调动人体自身免疫系统根除局部乃至全身的肿瘤，因此长期以来就是令癌症研究者兴奋的领域。自细胞因子被初次发现以来，基于细胞因子的肿瘤免疫治疗研究一直深入广泛的开展，因为它是相对容易纯化的注射型的癌症治疗试剂。但到目前为止，大多数细胞因子的治疗试验都低于预期，主要困难之一是细胞因子很难在病人体内达到治疗剂量而又不产生过度的细胞毒性。
新出现的基因治疗方法可能只在肿瘤局部持续产生的高浓度的治疗性的免疫刺激性细胞因子，而不刺激细胞因子整体水平的提高，不造成明显可见的细胞毒性，因此引起人们极大的兴趣。本文试图在这方面做一综述，并讨论与细胞因子免疫基因治疗有关的问题和可能的解决办法。

作为可能治疗癌症方法，免疫疗法在19世纪被纽约外科医生威廉Coley最初尝试。他观察到对极个别的自发性肿瘤自愈患者，病人常伴有偶发的感染(1)。何况，Coley企图通过注入细菌提取物来调动机体免疫系统的试验只获得了很有限的效果。
肿瘤免疫学的一个基本问题是机体免疫系统是否可以识别肿瘤细胞，因为它们大部分是来自机体自身的正常细胞。1909年，Paul Erlich
最先提出一种理论，认为机体免疫系统有对抗癌细胞的潜能(2)。但在随后的几年内，由于缺乏对免疫系统的分子和细胞水平的认识，不可能通过实验验证他的理论。因此，肿瘤免疫学领域的研究进展缓慢。
直到50年后，托马斯(3)和Burnet (4)提出了所谓的癌症免疫监视理论(5)。
这个理论是基于对器官移植生物学(6、7)和化学诱发肿瘤免疫(8-10)的进一步了解而提出，认为淋巴细胞能监视和清除机体内不断出现的新的肿瘤发生细胞，只有当免疫系统监视失败时才形成肿瘤。
70年代出现的一些关键实验似乎反驳了免疫监视理论(11)。在这些实验中，胸腺萎缩、T细胞严重缺陷的裸小鼠并没有出现肿瘤发病率的上升。特别明确的是CBA/H基因缺陷的裸小鼠并没有出现化学诱导或自发的肿瘤发病率的升高，也没有潜在发展肿瘤的明显减少。这些实验使肿瘤免疫监视理论显得过时(12)，然而后来了解到，从裸小鼠实验得到的体数据是不全面的。
首先,裸小鼠仍拥有少量的能够检测到的T细胞(13，14)。其次，裸小鼠有正常的数量的自然杀伤细胞(NK)(15)，能极大地影响肿瘤地生长；残余的T细胞和完好无损的先天免疫系统仍可以控制自发的或人工诱导的肿瘤。特定效应细胞或特定基因缺陷的转基因敲除小鼠的应用使人们有可能得到更确信的准确的实验结果以重新审查肿瘤免疫监视理论的正确性。这些研究极大地证实免疫监视理论(16)。例如，RAG-2基因(重组激活基因)缺损的小鼠，缺少淋巴细胞抗体基因的重排，T、B淋巴细胞和NK细胞联合缺陷，因此与野生型小鼠相比化学诱导的和自发的肿瘤发生率均升高(16)。

肿瘤免疫监视理论的重新审定极大的增强了从事肿瘤免疫治疗研究的工作者的信心，它重新肯定了动员机体自身免疫系统根除恶性肿瘤在体内生长的可行性。除了肿瘤免疫监视理论之外，肿瘤免疫学领域还有一些划时代意义的重要事件，包括：1)识别和纯化免疫刺激的细胞因子
(1918年至1923年)，它们在肿瘤实验模型中能提高机体对癌细胞的免疫反应(24-28)；2)有能力选择性扩增特定的免疫效应细胞如肿瘤特异性杀伤T细胞或NK细胞(29-37)；3)
各种肿瘤特异性抗原分子特性的鉴定，如neu (38, 39)，CEA (40-43)， PSA (44-46)，MUC
(47-50)等；4)确定树突状细胞(DCs)为主要的抗原提呈细胞（APCs）(51-53)；5)认识到肿瘤细胞通过各种方法躲避免疫系统(54、55)。换句话说，免疫系统在\"编辑删除\"具有免疫刺激抗原的肿瘤细胞而选择对免疫系统\"沉默\"的肿瘤细胞过程中发挥重要作用(16、56、57)。
目前大多数肿瘤免疫学者认为，免疫系统毫无疑问在肿瘤的发展过程中起着关键作用，并且在未来的癌症治疗中可能发挥中枢作用。我们已经清楚，肿瘤细胞表达特异性的抗原被免疫系统识别，同时又通过各种途径逃避免疫系统的攻击。肿瘤免疫学家们面临的挑战是理解肿瘤细胞和免疫系统相互作用分子的复杂性，并设计新的方法打破平衡，使免疫系统攻击肿瘤细胞。


细胞因子的发现预示着免疫学和癌症免疫治疗新时代的到来
细胞因子是一个细胞间信号转导多肽家族，由160多名成员组成。许多的细胞因子如白介素，具有调节癌症免疫应答功能，因此被深入研究以治疗癌症。1976年发现白细胞介素-2(18)标志着癌症细胞因子免疫治疗的开始。二十世纪八十年代纯化的足够数量的IL-2基因使细胞因子在癌症治疗中的应用获得了发展动力。更令人兴奋的是人们认识到IL-2是一种T细胞及自然杀伤细胞(NK)的生长因子及活化剂，而这两种细胞在机体对抗肿瘤细胞中有重要作用。最初的努力大多集中在使用细胞因子扩增所谓的淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)上(29、58)，它们主要是被诱导处于极度活化状态的NK细胞。注入LAK细胞具有很大的感染性，尽管对小鼠肿瘤有疗效(59、60)。
然而，这正是所谓的过继免疫治疗的开始，此法通常要注射同源的或同种异体的体内激活的免疫效应细胞以根除肿瘤，其优点是可以获取大量的体外扩增的免疫效应细胞。这种方法后来的模型就是输注体外扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TILS)(34、36)。在黑色素瘤和肾细胞癌患者中使用TILS导致显著的早期反应，然而，随机临床试验效果并不优于IL-2的单独应用
(61)。TILs和LAKs都是美国国立癌症研究所Steven Rosenberg和他的同事提倡的。
除了过继免疫疗法外，IL-2的到来激发了人们把它作为药理学试剂直接用于病人治疗的广泛兴趣，此法即被称为自动免疫治疗。最初的努力主要集中在全身性地注入IL-2激发体内广泛的对抗癌细胞的免疫。此法是基于鼠类动物肿瘤模型实验，该实验中直接注入IL-2有明显的抗肿瘤效应(62-65)。目前，IL-2在美国、加拿大和欧盟已经被批准用于临床上肾细胞癌的治疗，这是根据小规模临床试验反应率统计(1966年至1970年)而批准的。系统性毒性问题已严重限制了许多细胞因子在人类中的广泛应用。尽管发现IL-2带来了初期的研究热情以及很多临床前的数据都暗示了它潜在的抗肿瘤功效，但是明显的临床效果只见于有限的几例肾细胞癌和恶性黑色素瘤患者。除了缺乏功效外，另一个限制IL-2应用的主要因素是全身性的毒性问题，这些毒性包括低血压、血管渗漏、呼吸功能不全
(71、72)，
不太严重但限制应用的副作用包括恶心、呕吐、腹泻、肌痛、关节痛、皮肤红斑、瘙痒症。此外不常见的毒性包括心肌梗死、心肌炎、感染、肾衰竭、肠胃梗塞、死亡。肿瘤坏死因子α
(TNF-α)是另一个用于全身性抗癌治疗的细胞因子。它在70年代初因其具有强大的杀灭鼠类肿瘤活性而被确定(73)，在80年代(74、75)被克隆出来，自此以后进行了多项真对各种人类肿瘤功效的一期和二期临床试验(76-78)。肿瘤坏死因子α至少通过三种机制以消除肿瘤(79)：首先，它对肿瘤细胞有直接的溶细胞活性；第二，它可以选择性破坏肿瘤新血管系统导致肿瘤组织出血坏死从而杀死肿瘤(80、81)；第三，可以促进T细胞介导的肿瘤细胞免疫能力。因此，它具有强大的杀伤肿瘤活性甚至是对于TNF-α直接毒性不敏感的肿瘤。
大多数临床实验都由于TNF-α带来的严重的全身性毒性而告失败。由于副作用，如低血压、血管渗漏、发热和神经毒性，多数情况下都不能达到有效的抗肿瘤剂量(82)。
事实上，人类只能忍受2%/公斤的剂量，此剂量对抑制小鼠肿瘤是必须的(82,83)。然而，如果能集中到身体特定器官或器室并且达到有效的浓度，肯定能杀灭人类肿瘤(84，85)，利用肢体灌注TNF-α治疗骨肉瘤和转移性黑素瘤就是一个很好的例子(86)。
上述两个例子表明，基于细胞因子的免疫疗法是成功的，但其毒性/副作用必须得到解决。
除了毒性的副作用外，全身性注射细胞因子抗肿瘤疗法还有其固有的问题。这些问题是多方面的：有问题的系统注入新的激素治疗癌症的方法.
这些问题是多方面的：1)往往导致人为的高浓度的细胞因子，比系统水平高几个数量级，因此在大多数情况下，造成不必要的副作用，如前一节提到的毒性甚至致死问题；2)虽然全身性的细胞因子浓度，是机体正常情况的数量级倍，但在免疫系统需要激活的部位如肿瘤组织，细胞因子浓度远低于所需；3)大剂量注射细胞因子通常只引起浓度的短时的升高，然后迅速被机体的肝脏或肾脏清除。


因此，没有足够的时间来调动免疫系统对抗肿瘤细胞。要想用细胞因子激活免疫系统对抗肿瘤细胞，就必须重新认识机体自身的免疫系统是如何被激活来抵抗像细菌或病毒这样的外来抗原的。通常这些抗原进入人体各个特定部位，免疫系统通过其各种成分如巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞等识别这些抗原，产生局部的危险信号，然后高浓度的细胞因子提供旁分泌信号使各种免疫效应细胞向该部位聚集。局部细胞因子水平升高和免疫效应细胞聚集形成放大回路，，有利于清除入侵之敌，并在许多情况下产生记忆T细胞，当具有相同抗原的有机体再次侵入机体时，免疫系统可以展开迅速而有效的攻击。

从人体自身的免疫系统如何对入侵的外来有机体发起攻击，我们可以得到重要启示：局部的持续高浓度的细胞因子是激活免疫系统所需的。全身性注射，甚至是对宿主有致命毒性的浓度，也很难获得局部所需的高浓度细胞因子。

基因治疗方法大大改善了癌症细胞因子免疫疗法的应用前景
基因疗法出现于90年代早期，为细胞因子注入机体治疗肿瘤开辟了新的方法和机会。各种基因疗法的关键特点是利用基因治疗\"载体\"将治疗性基因转入局部(87-89)。这些载体包括病毒载体和通过重组DNA技术设计的非病毒载体，它们可以通过局部注射将基因运送到病灶，通常是肿瘤生长的地方(90)。肿瘤基因治疗的原理是这些地方会产生局部的细胞毒性(由于细胞毒性基因)或激发对肿瘤细胞的免疫。
使用局部基因注入的方法产生免疫刺激细胞因子的直接优点是：1)能够产生局部高浓度细胞因子，类似于人体自身对抗外来抗原的反应；2)能够以旁分泌效应方式提供持续高水平的细胞因子来激活免疫系统。
很多不同的基因治疗载体已被用于肿瘤的细胞因子治疗。种类繁多的病毒及非病毒载体已用于基因治疗的实验，其中有用于鼠类的反转录病毒载体，人类和猫的慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、鸡痘病毒、塞姆利基森林病毒、裸质粒DNA病毒载体和用基因枪融合的质粒DNA载体。
由于每种载体都有其优缺点，目前对癌症基因疗法的最理想载体还没有达成共识。然而，在上述载体中，鼠类反转录病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、质粒DNA病毒载体是最常用于试验研究的载体，因为它们比较容易操作和制备。他们亦是首批被评估用于人类临床治疗的载体。
细胞因子检测方法综述

细胞因子(cytokine)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称[1]。在免疫应答过程中，细胞因子在免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。细胞因子的检测不仅是基础免疫研究的有较手段，同时在临床疾病诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测方面具有重要价值。
但是，由于细胞因子在体内的含量甚微，给细胞因子的检测带来困维，细胞因子的检测尚未在临床诊断上广泛开展，已知目前采用的细胞因子检测方法均不完善，且不同的检测方法所得的结果差异较大，给临床诊断与治疗带来一定的困难。因此，有必要了解各种检测方法的特性及影响因素[2]。
目前，细胞因子生物学活性检测和浓度测定方法主要有以下几类

一.生物学检测法

生物学检测又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSF刺激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测[2]。生物活性检测法又可分为以下几类：

1．细胞增殖法
许多细胞因子具有细胞生长因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2刺激t细胞生长、IL-3刺激肥大细胞生长、IL-6刺激浆细胞生长等。利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株（简称依赖株）。这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依赖株ctll-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外长期培养。在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况（如使用3h-tdr掺入法、MTT法等）鉴定IL-2的含量。除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。

2．靶细胞杀伤法
是根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。通常靶细胞多选择体外长期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。

3．细胞因子诱导的产物分析法
某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺、IL-6诱导肝细胞合成α1-抗糜蛋白酶等。通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性。

4．细胞病变抑制法
病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。

二、免疫学检测法

细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。随着重组细胞因子的出现，可较方便地获得细胞因子的特异性抗血清或单克隆抗体，因此可利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。尽管细胞因子种类繁多，只要获得了针对某一因子的特异性抗体（包括多克隆抗体或单克隆抗体）均可采用相似的技术开展工作。常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印迹法。目前，几乎所有常见细胞因子的检测试剂盒均有商品供应。此外还可利用酶标或荧光标记的抗细胞因子单克隆抗体，原位检测因子在细胞内的合成及分布情况，如近来来发展起来的细胞内染色法和酶联免疫斑点（ELISPOT）技术等。免疫学检测法可直接测定样品中特定细胞因子的含量（用ng/ml表示），为大规模检测临床病人血清中细胞因子的含量提供了方便。本法仅测定细胞因子的抗原性，与该因子活性不一定相平行，因此要了解细胞因子的生物学效应，必须结合生物学检测法。

三、分子生物学方法

这是一类利用细胞因子的基因探针检测特定细胞因子基因表达的技术。目前所有公认的细胞因子的基因均已克隆化，故能较容易地得到某一细胞因子的cDNA探针或根据已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探针。利用基因探针检测细胞因子mRNA表达的方法多种多样，常使用斑点杂交、Northern blot、逆转录PCR，细胞或组织原位杂交等。实验的关键在于制备高质量的核酸探针和获得合格的待测物（提取的mRNA样品或细胞/组织标本）。核酸探针是指一段用放射性同位素或其他标记物（如生物素、地高辛等）标记并与目的基因互补的DNA片段或单链DNA、RNA。根据其来源可分为cDNA探针、寡核核苷酸探针、基因组基因探针及DNA探针等。其中cDNA探针和人工合成寡核苷酸探针常用于斑点杂交及Northern blot，而RNA探针因穿透性好更适用于原位杂交。核酸探针技术的应用已经程序化，以cDNA探针为例主要包括：①质粒DNA的提取；②靶DNA片段的分离；③靶DNA片段标记；④待测样品mrna的提取；⑤标记cDNA探针对待检样品的杂交；⑥放射自显影或显色分析。近年来出现的RT-PCR检测特异性mRNA的方法也广泛用于细胞因子研究领域。该法具有灵敏、快速等优点，甚至从1～10个细胞中就可检出其中的特异mRNA。

上述三种方法，各有优缺点，可互相弥补，在实际应用中，可根据各自的实验目的和实验室条件进行选择。生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能，是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。在检测细胞因子时，必须考虑到细胞因子的作用具有网络性的特点，人们需明确检测方法所测定的细胞因子成分，并考虑其抑制剂和可溶性受体的水平，将各种结合使用，有可能得到较为可靠的结果。