β-半乳糖苷酶（LACZ）酶活测定

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1. 在冰上解冻样品，同时准备裂解液（见下面关于裂解液样品的收集和准备的注意事项）。
  2. 准备若干(至少每个样品3个和空白一支)透明的塑料比色皿，每支装有500μl的碳酸钠终止液。你可以在比色皿上标明测试样品的名称和使用的时间。
  3. 在微量离心试管中加入如下试剂：
  􀁹400μl 磷酸钠盐缓冲液（pH 7.5）
  􀁹133μl ONPG溶液
  􀁹6μl 镁离子溶液
  4. 把反应混合物放置在37°C的水浴中或者加热垫上预温育。
  5. 一旦预热后，加入如下物质：
  􀁹60μl 细胞萃取物
  􀁹比较明智的做法是同时做阴性对照，即用抽提物或不表达β-半乳糖苷酶的细胞抽提物代替前述的细胞抽提物。
  6. 留心观察每个反应试管里黄色（o-硝基酚）的出现，在适当的时间点，从每种反应混合物中等量移取100μl的溶液，把它加到装有碳酸钠终止液的比色皿中。
  7. 当完成所有时间点测定后，在420 nm处测光密度，记录吸光值，并且计算吸光值与时间的斜率。斜率和β-半乳糖苷酶的活性成正比。注意：若在420nm处吸光值高于1.0，则不能采信。
  8. 在计算其实际活性时，先制作o-硝基酚标准曲线图，然后根据样品的吸光值在曲线上找出对应的浓度。一个酶活力单位是指酶在37篊每分钟可催化产生1 μmol的o-硝基酚。

收集和裂解细胞的注意事项
细胞培养物的收集
  1. 在适当的培养时间，取出1.6 ml的培养物放入微量离心管中，并把它置于冰上。
  2. 迅速将1.6 ml样品在涡旋混匀器上振荡，然后移出100μl放入已装有900 μL新鲜培养基的比色皿中。离心剩下的1.5ml样品，去掉上层清液，把沉淀迅速放在-80°C冷藏。(注意：样品要在-80°C而不是-20°C冷藏保存)
  3. 测量并且记录细胞培养物1：10稀释液的OD600值。（注意：OD600值将影响下一步中lacZ酶活力的计算）

细胞裂解
  1. 在冰上解冻沉淀。
  2. 在374 μL B-PER™ 细菌蛋白抽提试剂(Pierce product 78248)中重新悬浮细胞，再加入50ul蛋白酶和磷酸化酶抑制剂以及细菌细胞提取物（Sigma 产品P8465;按厂家说明再生），1 uL 34 mg/mL的氯霉素（用甲醇配制），6 μL 10mg/ml裂解酶（用蒸馏水现配，当使用大肠杆菌时可以省略这一步）
  3. 快速涡旋振荡一分钟。
  4. 在冰上培育5分钟。
  5. 此时，你就得到了可以用来检测lacZ酶活性的粗制裂解液，使用前面的方法，按照酶所形成的产物的数量/每分钟每OD600单位来测定活力。（注意：对棒状杆菌和红平红球菌，这种方法是采用裂解法时的最好测定方法）
  6. 对大肠杆菌样品，离心粗制溶解产物1min后放置于冰上。
  7. 你现在得到的是清亮的溶菌液（上清液中的细胞碎片已被去除）。蛋白质浓度用Bradford方法可以测定（另见蛋白质检测方案）。在清澈溶菌液中使用前面所介绍的方法检测lacZ酶活力，按每分钟每mg蛋白质所形成的nmol产物来测定。（注意：在测定酶活力的时候，用酶活力/mg蛋白质比用酶活力/OD600更恰当）

磷酸缓冲液（50 ml）49.6 ml蒸馏灭菌水
0.108 g NaH2PO4
0.528 g Na2HPO4
过滤或高压灭菌
10mg/mL裂解酶（1ml）
（若使用棒状杆菌和红平红球菌）
10 mg 裂解酶
加蒸馏水至1ml
现配并于冰上保存
ONPG溶液(10 ml)
10ml磷酸钠缓冲液
0.04g o-硝基-