免疫金标记技术在体外诊断领域的应用总结

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免疫金标记技术是一种将胶体金颗粒与包括抗原、抗体在内的许多蛋白质偶联而形成免疫金复合物的标记技术。除了许多领域应用以外，该技术目前主要应用于疾病的快速检测诊断和临床监测领域。
在过去的十年里，基于膜基础上的侧向层析和渗透层析快速诊断技术为免疫金标试剂开创了巨大的市场份额。免疫金结合物作为指示试剂，广泛的应用于诊断和检测感染性疾病、环境污染物、药物、心肌标志物、早孕以及兽医等领域。
如同其他标记结合物一样，采用优质的试剂（包括蛋白质和胶体金）、拥有丰富的生产经验以及对最终客户免疫金操作技术培训方面知识体系是该技术取得成功的关键。
蛋白质的偶联
在体外诊断领域，通常采用抗原或抗体与免疫金结合制备免疫金结合物。偶联抗体采用单克隆抗体或多克隆抗体，是影响抗体偶联的因素之一。
除了临床诊断中常见IgG抗体以外，IgM、IgE和IgA抗体也可以偶联上胶体金。偶联抗体时，必须考虑抗体的亚型。例如在小鼠IgG亚型中，IgG1亚型最容易偶联胶体金，而将IgG3亚型偶联胶体金面临较大的技术难题。
将抗原偶联胶体金也面临不同的技术难题。将常见的蛋白质抗原偶联上胶体金比较容易，但前提为结合到抗原上的胶体金对蛋白质抗原决定簇的影响小于50％。因此，免疫金和蛋白质结合方式对研发人员非常重要。
胶体金与蛋白质偶联的机理
研究人员普遍认为，三种特异的氨基酸残基在胶体金与蛋白质的偶联作用中发挥着重要的作用，而赖氨酸、色氨酸和半胱氨酸这三种氨基酸残基与胶体金偶联的作用机理各不相同。
•  赖氨酸带有较强的负电荷，因而能够吸附带负电荷的胶体金颗粒；
•  色氨酸主要通过疏水相互作用与胶体金相偶联；
•  半胱氨酸通过SH-与胶体金颗粒以共用电子的形式形成配位键。抗体通过这几种作用力与胶体金颗粒牢固、稳定的结合在一起。
在很大程度上，蛋白质与胶体金的偶联成功与否取决于上述三种氨基酸残基在蛋白质上的位置。在某种情况下，结合胶体金的氨基酸残基定位于蛋白质的活性部位，从而干扰蛋白质的反应活性。当这几种氨基酸残基定位于抗体的抗原结合部位或抗原的特异抗体结合决定簇部位时，如果偶联胶体金颗粒的蛋白质分子未做特定的处理就不可能克服这种空间位阻的干扰作用。
这三种与胶体金颗粒偶联相关的氨基酸残基在蛋白质中适合的定位对于达到最佳的检测灵敏度非常重要。就标记抗体来说，这三种氨基酸应定位于Fc区，而对于标记抗原，它们应远离抗原的反应决定簇位置。
结合的优化
在开发、优化单一标记的胶体金结合物时，研究人员通常制备小批量的大约60种不同的胶体金结合物。每种胶体金结合物在某一关键制备步骤与其它胶体金结合物不同，从而确定那种胶体金结合物对于最终的检测分析是最佳的符合反应需要的胶体金结合物。
这项调试应该包括所有可以改善胶体金结合物的灵敏度、交叉反应以及潜在稳定性的技术参数。用来检测的指标应包含但不应仅限于抗体工作缓存液、防腐剂的类型、盐度、表面活性剂含量、胶体金颗粒的尺寸、封闭剂的类型、总蛋白浓度、结合物工作缓存液以及结合物的浓度。例如，为了确定不同封闭剂的效果，可以按一下步骤进行调试：
•  封闭剂的类型（如caisein、BSA、卵清蛋白、人血清白蛋白、PEG、非特异性IgG）
•  封闭剂的纯度
•  封闭剂的含量
•  封闭剂对整个测试反应的兼容性
研发人员根据具体的小批量半成品试验结果确定最佳的上述试验指标。研发人员通常采用试制一种与最终检测产品尽可能近似的简易检测产品以确定小批量胶体金结合物的最佳指标。对于基于膜基础上的检测分析来说，通常采用仅需要捕获抗体、纯化抗原的最简易检测方法来评价小批量的胶体金结合物，在不必面临相关干燥技术、样本缓存液等技术指标的情况下确定胶体金结合物的最佳制备条件。
为了满足上述试验的要求，我们常常需要3mg抗体或者5mg抗原。采用小样样本，我们能够获得最优化的胶体金结合物生产指标，并能提供基本的样本评价。确定了最优的胶体金标记技术指标，生产商即可直接批量、可重复生产高品质的胶体金标记抗体或抗原。
用于胶体金标记原料的品质
用于制备胶体金结合物的特异抗体的稳定性取决于检测试验的技术条件。单克隆抗体是侧向层析分析中最佳的抗体类型。在这类检测分析中，一种单克隆抗体标记胶体金颗粒作为指示剂，而另一种单克隆抗体被固着于硝酸纤维素膜上作为捕获剂，而检测抗原上这两种单克隆抗体的相应抗原决定簇在空间位置上距离较远。
在侧向层析分析中使用的多克隆抗体必须经过A蛋白柱层析纯化。在多数情况下，亲和层析纯化的胶体金标记抗体具有较高的敏感性和特异性。这当然取决于符合试验检测可接受交叉反应的技术要求。
亲和纯化
硫酸铵沉淀或DEAE纯化的血清含有大量的可竞争性结合胶体金颗粒表面结合位点的杂蛋白，这些含有影响胶体金颗粒结合的三种氨基酸残基的杂蛋白很容易与带负电荷的裸露的胶体金颗粒结合，从而影响检测分析的结果并降低检测分析的灵敏度。
同理，如果的采用A蛋白或G蛋白柱层析纯化抗体作为胶体金结合物标记原料，由于抗体原料中含有大量的非特异性的IgG，导致胶体金结合物中含有大量非特异性的胶体金结合物，从而降低检测分析的灵敏度。
从层析柱上洗脱下的高亲和抗体的亲和层析纯化可以获得高亲和抗体，从而可以产生高特异性的胶体金结合物。虽然亲和纯化方法耗费大量的时间、经费、血清，但是通过该方法可以获取任何免疫分析必需的关键原料——高质量的结合物。
抗原的偶联
成功偶联抗原的关键取决于抗原的分子量和抗原上决定抗原与胶体金颗粒偶联的三种氨基酸残基的空间位置。
在快速诊断检测中，比如竞争法检测抗原、夹心法检测抗体时，需要胶体金标记抗原。在这种情况下，通常选择40nm胶体金颗粒作为标记物。研究人员发现，40nm胶体金颗粒标记的蛋白分子量下限为30KD。在某种条件下，通过特异的标记技术可以将40nm胶体金颗粒的标记下限降低到15KD。可标记胶体金颗粒的蛋白质分子量下限可以保证蛋白质有足够数量的赖氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基与胶体金颗粒相结合。如果蛋白质抗原不含有足够数量的半胱氨酸残基，抗原和胶体金颗粒之间的结合力相对较弱，尤其存在较高亲和力的抗体时抗原与胶体金颗粒之间的偶联容易断裂。
对于分子量低于30Kd的抗原，通常采用较小的胶体金颗粒进行标记，从而在检测线处由于胶体金颗粒小、可见度低导致检测的灵敏度降低。
对于含有较少或者没有上述三种特异氨基酸残基的抗原，可以通过预先偶联载体分子，比如BSA或KLH.这种预先偶联载体分子的方法比较复杂，有较强的专业基础。必须谨慎考虑连接物类型、长度以及半抗原与BSA的比例、载体分子类型等因素，确保抗原反应活性部位，如抗原决定簇无空间位阻，制备可重复生产的具有最大敏感性的蛋白载体胶体金结合物。
胶体金颗粒大小的选择取决于胶体金结合物的用途。如下段落描述了两个最常用的胶体金应用领域：显微检测技术和快速诊断技术。
1-40nm的胶体金结合物可以应用于电子显微镜和光学显微镜检测领域。即使在透射电镜放大25万倍的情况下，人们也不可能看到1-2nm的胶体颗粒。利用银增强胶体金技术可以让终端客户能够看到胶体金标记的这种较小的抗原性位点。
银增强染色技术是指通过银盐在胶体金颗粒表面沉积，使胶体金颗粒增大到在显微镜下能观察的尺寸。该技术具有批间差异较小、效率高、易控制的特点。1-2nm的胶体金颗粒便于接近抗原决定簇位点，不存在较大的胶体金颗粒有空间位阻等缺点。因而，这种较小的胶体金颗粒便于在特异位点结合而且一旦在抗原表面定位后也易于银增强染色技术实现。
在不采用银增强染色电镜技术的情况下，可以用相同胶体金结合物标记几个不同的抗原决定簇反应部位。比如，采用可分辨的胶体金标记特异不同决定簇反应位点的抗体。
40 nm的胶体金颗粒对于分子量为160kd、长度为8nm的IgG分子拥有最小的空间位阻和最大的敏感性。
40-100nm的胶体金颗粒比较容易偶联到IgG抗体上。较大颗粒的胶体金比40nm胶体金颗粒有较大的敏感性，但在520nm处较大胶体金颗粒在1ml溶液中的光吸收较小，而且较少在检测线处被捕获。同40nm或60nm胶体金标记的抗体相比，较大颗粒的胶体金结合物对1-10ng/ml分析物具有较低的灵敏度。
虽然60nm胶体金颗粒可以应用于快速诊断分析，但实际上很少应用于快速诊断分析。60nm胶体金颗粒与40nm胶体金颗粒的颜色稍微不同。优质的40nm胶体金为鲜红色，而60nm胶体金为深粉红色。在某种情况下，样本可使膜着色引起背景颜色，可以将这种轻微的颜色差异识别。比如，含有胆红素的样本留下的褐色背景容易看成粉褐色而不是红色。
如果用于标记分子的分子量小于160kd，20nm胶体金颗粒更适合用于标记结合物。20nm胶体金颗粒通常用于标记链霉亲和素、A蛋白和分子量小于60kd的抗原分子。
随着快速诊断领域的技术进步，胶体金结合物的灵敏度逐步提高。目前，在大多数快速诊断分析中，检测下限达到1ng/ml。如果采用高质量的抗体，快速诊断分析检测下限甚至可以达到10pg。随着银增强技术对检测灵敏度的进一步提高，或许检测灵敏度会提高10-100倍。
Conclusion
胶体金蛋白质结合物的制备过程并非轻而易举的。制备优质的胶体金结合物过程以及缺乏经验的生产商将面临产品批次的重复性、规模扩大等技术难题。