自杀性质粒载体的构建

yujian623

自杀性质粒载体完全可以自己构建，只要保证两点：１，自杀性质粒载体不能在你的宿主菌里进行复制，也就是说载体上不能有能在宿主菌中复制的复制子；２，要由筛选标记．

自杀性质粒载体不能在你的宿主菌里进行复制，否则会导致细菌染色体突变株的构建失败。但是在构建时，要注意以下方面：
1。在制备质粒载体和DNA插入片断时：2ug 5kb大小的线状DNA大约含有1.4poml/L5'末端磷酸。5‘突出端脱磷需要CIP0.01u/pmolDNA末端，平端或凹陷脱磷需CIP0.5u/pmolDNA末端。
2。连接质粒载体和DNA插入片断时：
（1）初次实验的可以建立几种不同的连接体系，比如插入片段与载体分子数比率可以为3：1，1：1，或1：3。
（2）可以尝试三种温度和时间的连接如4度，过夜；15度，4－6小时；25度，1小时。
3。细菌转化和筛选时：
（1）如果是感受态细胞，－80度储存的在5－6周后,转化率低。可用一已知标准闭环质粒鉴定感受态细胞的转化能力。
（2）用无DNA转化物的感受态细菌铺板，如果有菌落生长，说明其中抗生素浓度不够。