原位杂交的步骤及心得

yujian623

ISH的步骤：
1  脱蜡：  二甲苯I  RT  3min
    二甲苯II  RT  3min
    二甲苯III  RT  3min
2  水化  乙醇100%  RT  3min
    乙醇100%  RT  3min
    乙醇95%  RT  3min
    乙醇75%  RT  3min
    乙醇50%  RT  3min
    PBS  RT  3min
3  变性  HCl(0.2mol/L)  RT  20min
    PBS  RT  3min
4  去蛋白  PK（100ug/ml）  37 篊  20min
    PBS  RT  3min
    PBS  RT  3min
5  后固定  4%PFA/PBS  RT  5min
    PBS  RT  3min
    PBS  RT  3min
6  脱水  乙醇75%  RT  3min
    乙醇95%  RT  3min
    乙醇100%  RT  3min
    乙醇100%  RT  3min
7  干燥  通风厨  RT  1h
8  预杂交  杂交液  50 篊  1h
9  杂交  变性探针  80 篊  10min-〉冰
    稀释探针：1：80  滴片  压膜
    湿盒  50 篊  18h
10  洗片  50% 甲酰胺
4xSSC  37 篊  30min
    2xSSC  37 篊  15minX2
    0.1xSSC  37 篊  15min
    PBS  RT  3min
11  封闭  Washing buffer  RT  2min
    Blocking buffer  RT  30min
12  免疫  Anti-GIG-AP(1:250 Blocking buffer)  37 篊  1h
    Washing buffer  RT  15minX2
    Detection Buffer  RT  2min
13  显色  NBT/BCIP /Detection buffer
6.6/3.3/1000  37 篊  2h
14  蒸馏水洗      
15  水性封片  
心得：脱蜡前最好先将切片在60篊烤3~4小时，可使脱蜡效果更好。
  杂交液在下一步清洗前可以先用卫生纸擦拭干净，但注意不要将组织块擦掉。
  二甲苯是可以回收利用的，Ⅰ可以弃去，Ⅱ回收至Ⅰ，Ⅲ回收至Ⅱ，这样既节省试剂，也比较环保。
  去蛋白时PK消化时间很重要，太长会将组织完全消化掉，太短探针无法进入，需要根据自己的组织切片类型适当调整。