聚丙烯酰胺测序凝胶的制备

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试剂]（1）10％过硫酸胺过硫酸胺 1.0g加双蒸去离子水溶解后再定容至l0ml,4℃避光保存。（2）40％丙烯酰胺丙烯酰胺(Acrylamide) 76gN,N'-甲*双丙烯酰胺(Bisacrylamide) 4.0g加双蒸去离子水至150ml，将溶液加热至37℃使试剂溶解，再用双蒸去离子水定容至200ml。过滤后，室温保存于棕色瓶中。注意丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收，配制时需戴口罩，丙烯酰胺与N,N'-甲*双丙烯酰胺配制比值为38:2。（3）10×TBETris 108g硼酸 55g0.5mmol EDTA(pH8.O) 40ml调pH8.0,加双蒸去离子水至1L，高压灭菌后室温保存。（4）尿素(超级纯)（5）TEMED[仪 器]（1）序列分析电泳槽：如GIBCO BRL和Bio Rad产品。（2）高压电源：如GIBCO BRL和Bio Rad产品。[测序板的处理与安装]（1）用去污剂溶液清洗玻璃板和间隔条，用自来水彻底冲洗后，再用蒸馏水冲洗。用乙醇冲洗板并晾干。必须彻底洗净玻璃板，以确保灌胶时不会产生气泡。（2）测序板的硅化处理:每块玻璃板的面都需硅化处理，以防止凝胶与两块玻璃板紧贴并减少电泳完毕后从胶模中取出凝胶时凝胶发生破裂的可能性。硅化方法为；将拟硅化的玻璃板置于通风橱中，并戴手套操作，在拟硅化板面上加2-3ml 5％二氯二甲基硅烷(二氯二甲基硅烷5％溶于氯仿中)，用纸巾将硅化液涂布均匀，然后用去离子水洗净玻璃板,再用乙醇冲洗后晾干。如需要从玻璃板上去除原有的硅，可用KOH-甲醇擦拭之。KOH-甲醇配制为100ml甲醇中加5g片状KOH即可。（3）装板与封边:不同厂家的产品装板方法略有不同。但原则是将板的两侧及底边封严，在灌胶时不至于漏胶。以Bio Rad测序仪为例：将板的两侧放置好0.4mm的塑料间隔边条，安装固定用夹板，置于封胶底槽用,再用已配制好的测序胶25ml封底边(测序胶配制见下述)，待胶凝固后，用1.2％琼脂液(1.2％琼脂粉溶于l00ml 1×TBE中，加热溶解后用于封边)封2个侧边。[测序凝胶的灌制]用于配胶的丙烯酰胺的浓度取决于待分析DNA片段的长短，如要读出引物5'端50个核苷酸以内的序列，应配制含高浓度(12％-20％)丙烯酰胺的凝胶。距离引物端25-400核苷酸之间的序列，可从含6％-8％聚丙烯酰胺的凝胶中读取，距离更远的序列，则可通过4％或5%的聚丙烯酰胺凝胶来测定。通常用的凝胶浓度为7％。胶量的大小根据所用测序板容积而定。（1）取尿素42g，先用30ml双蒸去离子水加热溶解，溶解后迅速置冰浴中，摇动溶器避免尿素析出。（2）加10×TBE llml。（3）加40％丙烯酰胺溶液17.5ml。（4）再加10%过硫酸胺1.33ml，混匀。（5）用双蒸去离子水定容至100ml，混匀。（6）取25ml配制的胶液，置于一小烧杯内，加TEMED 70ul，迅速混匀，倒入已装好的测序板的封底槽内，将底边封严。（7）另外75ml胶液在倒胶前将TEMED 40ul加入。（8）将配制的剩余75ml胶液加入40ulTEMED，迅速混合，并开始灌胶。（9）用手托住制胶板，使之与水平面大约成45。角，用50ml的注射器吸取胶液，沿制胶板开放的顶端缓缓倒入胶液。为避免产生气泡，灌注胶液时应保持持续不断，必要时可将板自一侧向另一侧摆动以逐出注入胶液时可能产生的气泡。（10）当胶将灌满时，将胶倾至几乎水平的位置，将鲨齿梳尖端朝上，平坦的—侧进入胶的混合物，将梳子紧紧地压入胶中以在胶顶端形成约0.4cm深的凹陷。（11）待凝胶聚合后，将板两侧固定夹板取下并从底槽中取出，将两侧封边胶清除干净，重新装好固定夹板。（12）将测序胶板安装于测序电泳槽的下槽中，将测序电泳槽的上下槽中加入约800ml1×TBE，翻转鲨齿梳，使齿在先前形成的凹沟中戳入胶顶部约3-5mm。（13）预电泳，在50W恒定功率下，预热30min，待温度达55℃时开始上样电泳。加样前，拨出鲨齿梳，用缓冲液冲洗齿间间隔物以驱逐扩散出胶外的尿素和聚丙烯酰胺的碎片。