抑制消减杂交技术

yujian623

1996年，Diatchenko等发明。其依据的技术主要有两点：（1）抑制PCR所谓抑制PCR，是利用链内退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的“锅—柄”结构，无法作为模板与引物配对，从而选择性抑制非目的基因片段的扩增。（2）消减杂交。其基本原理及主要过程是：（将需要检测的细胞称为“检测子”，将对照细胞 mRNA称为“驱赶子”）（1）用识别4碱基的限制酶RsaI或HaeⅢ酶切，该酶约在44=256bp处就有一个切点，一分子而来的双链cDNA经该酶酶切后，可产生数个片段，每个片段一般﹤600bp，可防止长链cDNA片段所形成的复杂结构对有效消减杂交的干扰。（2）将tester cDNA分成均等的两份(1和2)，分别连接上去磷酸化的接头(接头1和接头2)到其5′端。接头1和接头2分别是具有一段反向末端重复序列的寡核苷酸序列，以利于随后的选择性扩增。（接头设计特点：①接头是由一长链(约40余个核苷酸)和一短链(约10余个核苷酸)组成的一端是平端的双链DNA片段，而且双链的5′均无磷酸基团，保证了接头以唯一方向与cDNA片段连接，即接头长链的3′端与cDNA双链5′端连接；②接头长链外侧(约20余个核苷酸)序列与第一次PCR引物序列相同，内侧序列与第二次PCR引物序列相同；③在接头上含有T7启动子序列，并且含有内切酶识别位点，为以后该片段插入克隆载体提供酶切位点。）（3）将过量的driver cDNA分别加入两份tester cDNA中，变性后退火杂交。第一次杂交后有4种产物a、b、c、d：a是单链tester cDNA；b是自身退火的tester cDNA双链；c是tester和driver的异源双链；d是driver cDNA。第一次杂交是使tester单链cDNA均等化，即是原来有丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致。这种均等化的实现是依据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA。同时，由于tester cDNA中和driver cDNA序列相似的片段大都和driver形成异源双链分子c，使tester cDNA中的差异表达基因的目标cDNA得到大量富集。（4）第一次杂交后，合并两份杂交产物，另加上新的变性driver单链，再次杂交退火。在这一次杂交中，只有第一次杂交后剩余的经均等化和消减的单链tester cDNA能与driver cDNA一起形成各种双链分子。这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA，并产生了一种新的双链分子e，这种分子的两个5′端有两个不同的接头(接头1和接头2)，正是由于这两个不同的接头，使其能在以后的PCR中被有效的扩增。（5）两次杂交后，填平粘性末端，利用巢式PCR原理进行扩增，将两个长接头序列设计成内外两对引物，先用外侧那对引物进行PCR反应。e型分子两端都能和引物配对，扩增效率高，而c型的双链分子只在一端有一个引物配对，扩增效率比e型分子低得多，b型分子由于两端有长序列的反向重复，可互补形成牢固的“锅—柄”二级结构，无法进行有效扩增。第二轮PCR再用内侧那对引物进行配对，可极大提高扩增的特异性，使在最后的PCR产物中绝大部分是e型分子。以PCR扩增产物为探针与对比细胞的mRNA进行Northern印迹或者cDNA文库进行Sorthern印迹杂交以确定差异片段的特异性，克隆杂交为阳性的cDNA片段，对其进行序列测定、序列同源性分析等一系列工作。从而进行完整的基因克隆、鉴定。SSH有许多优点：（1）SSH方法通过它的两次特异性杂交和两次PCR特异性扩增使得假阳性率大大降低。据德国Stein等报道，它的真阳性率高达94%；（2）灵敏度高。通过均等化作用和对目标序列的富集，保证了低丰度mRNA也有被检测的可能。一般说来，经过SSH，稀有丰度cDNA能富集1000-5000倍，这种富集作用使得低至每细胞一个拷贝的分子也有可能被检出；（3）提高了基因克隆的效率，由于使用四碱基内切酶使得基因(组)的复杂程度降低，大大提高了信息量，在一次SSH实验中可同时分离出上百个差别表达的基因；（4）程序相对简单，操作简便易行，实验结果复杂程度低。但SSH对起始材料相对要求较多(需数微克)，使其不适于来源困难的样品，且若为cDNA SSH则需来源样品保持新鲜以防RNA降解造成信息的丢失。1997年Stein等把SSH和反式Northern相结合，将第二次PCR的产物克隆到载体中，利用colony PCR对其进行第三次扩增，再用反式Northern对扩增产物进行筛选，进一步降低了假阳性和提高了对低丰度mRNA的显示能力，也大大减少了工作量。