双交换自杀载体构建方法经验谈

双交换自杀载体是构建双交换突变株的核心步骤。
而双交换突变是研究基因功能的必要手段。
以我们实验室的经验，构建双交换自杀载体，一般采用两种方法，一种是直接扩出含有需要研究的基因完整编码区在内的几Kb的大片段，然后在该基因编码区中间找一个合适的酶切位点，插入抗性，然后将此片段和自杀质粒连接。
另一种是，分别扩出需要研究基因的上游和下游同源区，然后上下游之间插入抗性基因，整个片段连在自杀质粒上。
上面的方法都属于有筛选标记的双交换。至于没有筛选标记的双交换自杀质粒以及其筛选方法我这里不讲了。
以我们实验室的情况，构建的双交换自杀载体，第一种方法更加快捷，但PCR扩长片段我们实验室都不甚常用，有学生的老板在美国的实验室主要采用这种方法，但他的学生在国内也很少这么做。
而分别扩出上下游片段，然后和抗性盒、自杀质粒相连构建自杀载体是我们目前最常用的方法。
四个片段得到后，可以四个片段连接转化，用多抗性筛选转化子。不过这种方法有时候很不好说究竟哪里出了问题：感受态效率不行？片段不够浓？酶切的有问题？片段之间比例不适合？总之一旦总也连不上就容易让人烦躁。我有过一次连接体系转化出一个转化子，并且就是我需要的抗性插入方向的情况，也有过花了两个星期，四个片段怎么也连不出转化子的经历——甚至先三个片段相连，再连抗性盒都不行。
于是用重叠PCR把上下游用PCR的方法整体扩出来是个不错的选择。
但是这需要我重新设计引物，麻烦。
于是我就把上下有用连接酶连接，16度过夜后电泳发现两个片段连成了可以视为染色体的大片段，然后用这个连接体系当模板做PCR（引物为上游同源区上游引物+下游同源区下游引物），很显然得到了我需要的两片段相连的大片段。
另外我还自己构建了个有多克隆位点的质粒，可以以此为基础来一个片段一个片段的往上连。
自此，我终于不再将构建自杀载体需要花费多少时间视为运气问题，10天足以。
也许这比一次性构建成要多花些日子，但对于大批量的做双交换却是实惠的。
由于兴趣不在生物，所以表达不行，哪位要是看不懂千万别怪自己理解能力不强。
拿两分走人。