PCR技术在DNA工程中的应用

yujian623

引言 　　对DNA片段在按特殊要求进行修饰上PCR技术提供了一种比原有技术更快更简单的方法。因为与重组DNA技术相比，PCR技术本身就较为简单;而且它还可以通过化学合成寡聚核苷酸引物的方法更为简便地改变DNA的碱基序列，而不需对DNA片段进行限制 性内切酶和连接酶操作;再者，PCR技术还可能很方便地进行序列改造，如在引物5'端加上一个“添加”序列(add-on sequences)。此外PCR技术产生的修饰产物效率几乎可达100%。
  Scaharf等人首先提出PCR技术可以很方便地将酶切位点导入DNA片段中，这只需将这些序列加到寡核苷酸引物的5'-末端上。虽然这些序列与模板DNA是不配对的，但在大多数情况下，它们几乎不影响扩增的特异性和扩增效率;特异性显然是由内引物的3'-末端决定的。当带有这些“添加”引物的DNA链进行在我复制时，这些添加的内切酶位点序列也就“安装”到由此而扩增出的PCR片段中，目前已有人报道长达45个碱基的添加序列。 　　通过PCR引物引入DNA序列变异的原理是非常有用的。最为简便的是它可以使PCR 产物的一条链或另一条链或两条链都特异性地标记上放射同位素、生物素或荧光素。它还可以在DNA序列的任一位置上进行改变，或用来在任何所需的连接点进行DNA序列的重组。
  用引物标记PCR产物
用γ-32P-ATP直接将一个PCR引物磷酸化(Kinasing reaction)，然后在标准PCR反应中直接使用标记的引物来扩增出一端带有标记的片段。将这种末端标记法应用到通过Maxam-Gilbert或磷酸硫代化学法对产物进行直接测序，以及合成一些适用于进行蛋白质的结合/保护分析(binding/protection assays)或“足迹法”的DNA序列。PC R技术是一种在体外合成用于蛋白“足迹法”分析所需DNA片段的简便方法。蛋白“足 迹法”分析不依赖限制性内切酶位点并且比限制性内切酶片段的分离和末端标记更为简便。
生物素可以标记到一个寡核苷酸引物的5'-末端上，其结果并不影响PRC反应。这为用抗生蛋白链菌素─或抗生物素蛋白─酶共扼物检测杂交PCR产物提供了一个非同位素法，它还可以用抗生蛋白链菌素柱(Streptavidin─columns)将产物的一条链与另一条链分开;此外，它还可以对PCR产物进行定量。同样，也可制备用荧光标记的寡聚物并应用在PCR技术中。带有不同荧光标记的特异性引物可以区分从不同位点扩出 来的PCR产物。
在PCR产物的末端导入有用序列
内切酶的识别位点可被加到单个或两上PCR引物的5'端上。这些位点有助于扩增片段插入到克隆载体中。在扩增产物的两端加上不同的酶切位点，产生的特异性的粘性末端就可直接进行克隆转化。在设计“添加”内切酶位点的序列时，最好在标准识别序列的5'末端另外再多加几个碱基，以免处于片段最末端的酶切位点可能不被内切酶所识别。用这种方法加到PCR片段的其他序列还有RNA聚合酶的启动子。这些富含G+C序列是为了增强变性梯度凝胶电泳的分辨力，以使它能区别出单碱基差异的不同片段。
由PCR产生的突变和重组
Mullis等指出PCR技术可以用来“装配”重叠寡核苷酸使之成为很长很长的PCR产物，从而获得比用直接化学合成法具有更多产量的全合成DNA模板的两年PCR产物准确地连接起来。从同一模板的不同区域扩增出来的两个PCR产物，经过这样处理后，得到的片段在序列上能相互重叠。这些产物可经过混合，变性及退火。在异源双链中有一条链在3'-末端发生重叠，利用与其5'-末端配对的引物，来扩增这个异源杂合双链，我们就可以从由两上次级PCR产物准确地连接成的片段混合物中调出一个片段(按Mullis的说法)。由于特生的扩增，PCR反应中的绝大多数产物是我们所需的重组DNA片段。 　　通过引物导入的序列变异因化学合成的引物长度有限而受到限制，但此法与PCR 片段连接法组合使用，可在片段的任一位置引入变异，而不仅仅是在其末端引入。重组所需的重叠序列不必存在于天然模板，可设计成添加序列进入引物。这样，通过PCR技术几乎可在DNA片段任何位置上特异性地进行位点替代、缺失和插入，同时它还可以将本来毫不相关的序列准确地连接起来。 　　有报道用这种PCR方法可将替换位置于300-800bp的PCR片段的中间部分。Vallette 等也报道了用添加序列的方法来获得插入和缺失。Horton等准确地将四个不同序列重组最终产生一个970个碱基的DNA片段，该片段编码镶嵌型小鼠第一类MHC蛋白。Hortor 称这种方法为SOE，或重叠延伸拼接法(Splicing by Overlap extension)。
PCR反应中的无用突变 　　
若PCR产物是用在集合(aggregate)反应中，那么在扩增过程中产生的低水平、随机的突变并不影响最终结果，因为绝大多数分子在任意位点上的核苷酸都是正确的。然而，若PCR产物是用来克隆的，例如克隆入表达载体，那么克隆在载体中的分子若在序列上发生不需要的变异将影响最终结果。这是用PCR方法与重组DNA方法相比最为严重的弊端。 　　在一个逆向反应中，已经分析出Taq DNA聚合酶每9.000个核苷酸中就存在一个错误掺入的核苷酸，每41.000个核苷酸中就将发生一个移码突变。预料，PCR反应经过 20次复制倍增(Doubling)后，将使DNA分子随机突变为900个碱基发生一次。然而，在 PCR条件下的错误掺入，并不一定总是在最终产物中产生序列差异。虽然Taq聚合酶没有3'到5'的外切酶校正功能，使得错误掺入的碱基不能被除去，但它可使延伸的DNA 链终止。在这种情况下，这些错误将不会在随后的PCR循环中蔓延。 　　对已经克隆的来自同一扩增出反应的PCR产物，测序结果表明序列突变频率较大。一项研究比较了PCR扩增出的HLA基因序列的克隆，发现在大约25个倍增复制后， 平均400个碱基中就有一个发生错误掺入。然而，Goodenow等21检查PCR扩增的HIV序列的克隆子，发现克隆子之间的序列差异至少比同样数目倍增复制产物少10倍。HoT Horton等人采用限制循环次数也对这种物异性突变进行研究，分别发现:在3900个碱基的序列中有一个无用的突变，及在1800个碱基的序列中有一个。这个比率还是可以接受的。造成这些变异的原因目前尚不清楚。复制倍增次数、扩增的条件以及需扩增 的序列长度等可能影响无用突变频率。 　　从目前情况看，进行反应的dNTP浓度最好在50-200mmol之间(太高的浓度将产生错误掺入)，引物的退火温度应尽可能地高(这样错误掺入就更可能导臻链的终止)，滞留在高温下的总反应时间也应尽可能地短，以防止DNA被降解而产生更多的错误掺入，因而要使用最少的PCR循环。在使用PECI热循环系统时，变性温度一般为30秒就足够了。对于小于1kb的片段，引物退火和链延伸的时间最多为30秒。 　　由于PCR产物中突变多少是与已经发生突变DNA复制次数成正比的，因而最好采用最少PCR循环制备出足够的DNA量。所以起始反应就需要尽可能多的模板。值是注意的是:理论上，在10次复制倍增和20次复制倍制之间产间错误掺入频率仅两倍之差，但在实际扩增中，却是1000倍的差异。 　　在这方面开展了大量的工作及实验，建议用经过测序验证没有无用突变的PCR产物进行克隆。对于较小的靶基因，非理想突变发生几率也较小。 　　在PCR技术的应用中，着重于使用直接休学修饰的PCR引物在扩增片段中导入所需的变异。它是在DNA片段末端加入标记和/或新的序列的最简单途径。它也可在两个PCR产物之间另创一个重叠序列而使它们很容易地进行重组。 　　在新的大分子研究中，重组PCR(将组合PCR片段的反应都归入这个名词下)是一个具有潜力而有效的新方法。它能很容易地产生特异性的新DNA重组序列。重组DNA法还大大地简化了检验由这些基因编码的新蛋白的工作。人们可以想象PCR产物可以直接进行体外转录/翻译。若目的蛋白活性可以特异地、灵敏地进行检测，那么体外产生的蛋白数量可能就足够用来检测所需的特性。最令人满意的PCR产物就可以高产率地进行克隆和表达。