ATP的生物合成

yujian623

一、目的
1.了解ATP生物合成的意义。
2.掌握无机磷的测定方法。
3.掌握DEAE-纤维素薄板层析法测ATP的形成。

二、原理
在适当条件下，酿酒酵母分解发酵液中的葡萄糖，释出能量，同时还利用无机磷，使AMP转变成ATP，一部分能量即贮存于ATP分子中。因此，在发酵过程中，可测得发酵液中的无机磷含量降低和ATP含量的上升。

三、实验器材
1.酿酒酵母，新鲜酿酒酵母悬浮于蒸馏水中，离心，弃去上清液。如此用蒸馏水洗涤酵母数次，最后将洗净的酵母沉淀冷冻保存①。
2. AMP、 ATP标样
3.烧杯50 或100ml (ⅹ1)。
4.电子分析天平。
5.水浴锅。
6.离心机4000rpm
7.722型（或7220型）分光光度计。

四、实验试剂
1.2%三氯醋酸溶液：2g三氯醋酸，溶于100 ml蒸馏水。
2.过氯酸溶液：0.8 ml过氯酸，加蒸馏水8.4 ml
3.阿米酚试剂：称取阿米酚[amidol,二氢氯化-2，4-二氨基苯酚，分子式：
（NH4）2C6H3OH·2HCl]2g，与亚硫酸氢钠（NaHSO3）40g共同研磨，加蒸馏水200ml，过滤贮棕色瓶内备用。
4.钼酸铵溶液：20.8g(NH4)6Mo7O24•4H2O，溶于蒸馏水并稀释至200ml.
5.1mol/L KOH溶液。
6.1mol/L HCl溶液。
7.ATP溶液：称取ATP晶体（或粉末）50mg，溶于5.0ml蒸馏水，临用时配制。
8.DEAE-纤维素薄板：参看辅助试验。
9.1mol/L NaOH溶液。
10.0.05mol/L pH3.5柠檬酸钠缓冲液：见辅助试验。
五、操作
1.发酵
将0.1g KH2PO4及0.58g K2HPO4溶于3ml蒸馏水。另将0.1g AMP溶于1ml蒸馏水，倾入上述磷酸钾溶液内，加热至37℃。酵母液5ml，再加4ml蒸馏水稀释，加热至37℃，倒入上述溶液中，再加MgCl2 0.016g及葡萄糖0.5g，再加蒸馏水3ml，混匀，立即取样0.2ml，检测AMP及无机磷的含量。此时测得的磷称为初磷。薄板层析图谱上只有AMP斑点，无ATP斑点。以后每隔30min取样测定，至明显看出无机磷及AMP含量下降、ATP含量上升即可（约2h～3h）。
2发酵液样品处理
将所取之0.2ml样液置离心管中，立即加入2%三氯醋酸溶液1ml，摇匀，离心（3000r/min）10min。上清液用以测无机磷及ATP含量。
3.无机磷测定
吸取上清液0.3ml置于干试管内加过氯酸溶液8.2ml、阿米酚试剂①0.8ml、钼酸铵溶液0.4ml，混匀，10min后比色测定A650nm。
本实验无需求出无机磷的绝对量，故不作标准曲线。A650nm数值下降即表示无机磷下降。一般情况下，当A650nm下降至比初磷A650nm小0.2单位时，发酵液中既有较多的ATP。
4.DEAE-纤维素薄板层析法测ATP的形成：方法见辅助试验，同时用ATP溶液作对照。
最好放在低温冰箱冷冻结冰。经深冻得酵母，发酵效果好。
阿米酚试剂为还原剂。如用抗坏血酸，效果不好。

辅助试验
一、目的
掌握DEAE—纤维素薄板层析法测定核苷酸的原理和方法。
二、原理
二乙氨基乙基纤维素，简称DEAE—纤维素，结构式如下：

带负电荷的核苷酸离子就被交换上去。控制溶液的pH，使各种核苷酸所带净电荷不同，与DEAE—纤维素的亲和力也就不同，从而达到分离的目的。
三、实验器材
1.   玻璃片4×15cm（×4）。
2.   尼龙布。
3.   pH试纸（pH1～14）。
4.   电动搅拌器。
5.   水平板。
6.   水平仪。
7.   铅笔。
8.   紫外分析仪（254nm）。
9.   电吹风。
10. 烧杯1 000ml(×1)。
11. 吸滤瓶1 000ml(×1)。
12. 布氏漏斗