质粒的酶切鉴定及片段回收

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一、小量酶解反应
  主要应用于质粒的酶切鉴定。10ul反应体积中含1mg DNA，酶切反应体系如下：
   质粒DNA   1mL
   10×缓冲液  1mL
   两种限制酶各 0.5mL +0.5mL
   双蒸去离子水 7mL
   总体积  10mL

[操作方法]
  按下列顺序加入试剂：
  (1)在一灭菌的新的Ep管中加入7ul双蒸水。
  (2)加入10×缓冲液1mL 。
(3)加限制酶Kpn I 0.5mL，Sac I 0.5mL。
  (4)最后加入质粒DNA lmL。
  (5)稍离心，混合。
  (6)37℃水浴1—1.5h。
  (7)取出后电泳分析鉴定是否酶解。

[注意事项]
  (1)双蒸水为可变体积，当其它反应成分确定后，用双蒸水将反应体积补足。
  (2)质粒DNA最后加入，以防止操作不当引起试剂的污染。
  (3) 大多数限制酶均加50％甘油缓冲液置于-20℃保存，其活力，稳定，但在配制反应混合物时，酶的加入量要准确限制小于总体积的l／10，否则甘油会抑制酶解反应。  

二、冻溶法从琼脂糖凝胶中回收DNA
  在重组DNA或探针标记等实验中，常常需要从凝胶中回收和纯化DNA，常用的回收方法有：压碎浸泡法、透析袋洗脱法、低熔点琼脂糖法和DEAE—纤维素膜法等。

[操作方法]
(1) 从琼脂糖凝胶中将含有拟回收DNA片段的胶块切下，置于Ep管内。
(2) 用一次性注射器将胶由针头处挤入Ep管内，加等体积Tris平衡酚混匀后，置液氮10min。
(3) 取出离心，5000g，5min。
(4) 小心地将水相转移至另一Ep管中。
(5) 加等体积酚：氯仿（1：1）充分混匀。离心，5000g，5min。
(6) 将水相转移Ep管中，加等体积氯仿：异戊醇（49：1）充分混匀。
(7) 离心，5000g，5min。
(8) 在转移出的水相中加1／10体积3mol乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的预冷的无水乙醇置-30℃30min。
(9) 离心，12000g，15min．
(10)弃上清，加预冷的70％乙醇1ml，12000g，离心5min。弃上清，室温放置数分钟。
(11)将沉淀用20ul TE缓冲液(pH8.0)溶解，-20℃保存备用。