外源DNA片段在质粒载体中的克隆

yujian623

DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。

实验目的：学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将BAC克隆所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUC18载体上。
实验材料：外源片段来自一个含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片段；克隆载体为PUC18。
实验原理：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。
实验步骤：
1．载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：
（50 ml反应体系，用1.5ml tube，冰上操作）：
DNA            30 ml
R.E              1 ml
10×buffer        5 ml
ddH2O              14 ml
37℃反应1hr，分别取8 ml 外源片段酶切产物和5 ml PUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全；按2－5步纯化、回收DNA
2．加入ddH2O 150 ml （扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000g离心10 min；
3．吸取上清，加1/10体积3M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20℃放置15分钟以上；
4．12000g 4℃冷冻离心15分钟；
5．倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10 ml ddH2O（0.5ml tube中），PUC18溶于20 ml ddH2O（1.5ml tube中）；
6．按以下反应去除载体PUC18的5’磷酸基团，50℃反应30 min 以上
DNA                         20 ml
CIAP（TaKaRa）          0.5 ml
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