植物原生质体的培养

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一. 实验目的：
通过实验掌握原生质体的获得与培养技术
二. 实验原理：
植物原生质体就是除去了细胞壁的一个为质膜所包围的的裸露细胞，用酶降解法脱去细胞壁的具有活力的原生质体，其在合适的离体培养条件下具有繁殖，分化，再生成为完整植株的能力。利用原生质体便于开展那些因细胞壁存在而难以进行研究的问题，如质膜的表面特性，细胞壁的形成，细胞器的摄取，体细胞的杂交及作为基因式程研究的良好受体系统，通过导入特定基因，获得转基因植株等等。植物原生质体作为一种研究系统，如同在细胞水平上研究某些问题，比在组织、器官或个体水平上有方便之处。
三、实验材料，试剂和仪器
1．材料
无菌烟草叶片
目前已经从高等植物的根、茎、叶、果实、种子等各种组织和器官分离得到原生质体，叶片、愈伤组织和悬浮细胞是容易取材的常用材料，若利用无菌苗可免去表面灭菌的操作步骤避免因条件不适而产生的材料生长的不良影响。
2．试剂
1）酶混合液
按1g材料加入10ml，酶混合液的比例配制。
配制分两步进行：

用重蒸馏水溶解，调pH5.6，定容至10mL，为酶储备液，灭菌备用。
（2）使用时，再加入纤维素酶 R—10   1%
果胶酶 R—10        0.8%
因酶制剂经过高压灭菌处理后会失活，故先将酶储备液灭菌，待用时再将酶制剂按比例加入到第一步已灭菌的溶液内。
（3）一般酶制剂都不太纯，配好后要经3500rpm离心5min，弃去其中杂质，吸取上清液备用。（所用离心管、滴管等均应经过高压灭菌）
2）洗液
CaCl2·2H2O      8mmol/L
NaH2PO4·2H2O   2mmol/L
甘露醇            0.5mol/L
3）Kg培养基
大量无素： 微量元素：
KNO3         2500     MnSO4·4H2O 10
NH4NO3       250       ZnSO4·7H2O  2
(NH4)2SO4     134       H3BO4        3
MgSO4·7H2O  250      KI            0.75
CaCl2·2H2O   900       Na2MoO4·5H2O 0.025
CaHPO4·H2O  50       CoCl2·6H2O 0.025
铁液： Na——EDTA 37.2
FeSO4·7H2O 27.8

有机附加物：肌醇 100
盐酸吡哆素 1
盐酸硫胺素 10
烟酸 1
激动素 0.2
萘乙酸 0.1
蔗糖 13700
木糖 250
(pH5.6 单位除注明的以外，其它均为mg/I)
通常我们将大量元素、微量元素和铁盐分别配置成10倍或100倍的母液，低温保存，在配培养基时，按比例吸取。
3．仪器
（1）大型仪器：
高压灭菌锅，超净工作台，离心机（4000rpm/s），倒置显微镜，振荡培养箱
（2）一般实验用品
细菌过滤器，滤膜，小滴管，小烧杯，大小培养皿，刻度离心管，小漏斗注射器10mL，小三角瓶50mL，不锈钢网300目，透气膜

四、实验方法
1．原生质体的分离
（1）将按上述配方配置好的培养基、洗液、需要灭菌的酶混合液及一般实验用品，用纸一一包好，0.1大气压灭菌20min。
（2）在超净台内将无菌烟草叶片从培养瓶内取出，放在培养皿内萎蔫1hr。如直接取室外培养的植物叶片，需进行表面灭菌，70%乙醇浸泡5s，无菌无水冲洗2次，再以2%次氯酸钠浸泡10min，无菌水冲选3~4遍。
（3）在灭过菌的酶混合液中加入纤维素酶、果胶酶，待溶解后放入离心管内，3500rpms离心10min，弃沉淀留上清夜为酶混合液。
（4）在超净台内，用注射器抽取酶混合液，转入细菌过滤器（用无菌镊子夹取0。45um滤膜装入），向下缓缓压夜过滤，收集于小三解瓶中，封透气膜待用。
（5）把萎蔫（或灭菌）的烟草叶片至培养皿中，用小解部镊子撕下表皮及去叶脉，将叶片剪成0.5cm2的小块（不易太小，否则会得到过多地破碎细胞），浸在酶混合液中，封透气膜。黑暗振荡培养，保持27℃，酶解12-24hr，振速为50~60rpm/min.

2．原生质体的收集与纯化
（1） 取出装有酶解好材料的三角瓶，重新置于超净台内，将酶解物用小漏斗（加入300目不锈钢网）过滤，不锈钢网目的大小视分离的原生质体大小而异。过滤液收集于10mL刻度离心管中，500rpm离心2min，未消化完的细胞团或组织留在下锈钢网上面。去掉酶液，留沉淀即收集的原生质体。
（2） 用洗液和培养基将酶混合液洗干净，以免在以后培养时残留的酶液会影响原生质体壁的再生。用lmL洗液加到沉淀中，轻轻摇动，用力不可太大，以免原生质体破裂，500rpm离心2min，弃上清液，留沉淀，并重复1次。再用1mL，培养液将沉淀以轻打起，500rpm离心2min，弃上清液留沉淀。以上几步离心均在超净台内操作。

3．原生质体的培养
（1）用2mL培养液将沉淀轻轻悬起倒入2个小培养皿内，只需一薄层即可。用封口膜封口，以防污染和培养基中水份散失赞成渗透压提高，对原生质体是一种冲击，以至对其完整性的破坏。
（2）将小培养皿放在一装有湿滤纸的塑料袋中，要求在散射的暗淡光（强光刺激会使原生物质体致死）和湿润环境培养，温度25℃。第二天用倒置显微镜观察原生质体生长情况，视野内呈现出很大而圆的原生质体。2~3天后细胞壁再生，可用照相记录每天观察的结果。
（3） 原生质体密度：除在极少数富营养培养基中原生质体可以单个培养，并进一步分裂外，它其它培养基中培养原生质体必须有一定密度，不然难以分裂。密度参数值是104~105个/mL，确切的密度应该随材料、培养期其它条件不同而异。
（4） 原生质体再生
具有活力的原生质体在合适的培养条件下，3~6天就可以看见原生质体的第一次分裂，2周左右可见到小细胞团。要不断加入新鲜细胞培养基，加入的时间和容量按实验的情况而异，原则上要在原生质体一次或几次分裂后逐步再加入。
细胞团继续长大成愈伤组织到植株分化的过程与其它组织培养的情况相同。