细菌转导

yujian623

一、实验原理

随着分子遗传学的发展，转导已成为遗传学分析的常用方法。所谓转导就是利用噬菌体为媒介将一个细胞（供体）的遗传物质传递给另一个细胞（受体）的过程。转导可分为二类：（1）普遍性转导；（2）局限性转导（专一性转导）。本实验以局限性转导为例，用λ噬菌体专一性转导半乳糖发酵基因的现象来说明转导的基本原理，并初步掌握转导实验的基本技术。实验中所采用的供体菌株是E.coliK12（λ）gal+。当此细菌受紫外线诱导后，原噬菌体被释放出来，其中有一定比例的噬菌体带有邻近的半乳糖发酵基因，我们称这种噬菌体为转导噬菌体（即λdggal+）。当转导噬菌体（λdggal+）感染受体菌E.coliK12gal-时，少部分（约三分之一）形成稳定的转导子，大部分（约三分之二）以杂基因子的形式形成不稳定的转导子。整个转导过程见图15-1。





三、实验器具和药品

1.用具：培养皿（9厘米），三角瓶（150毫升），试管（15×1.5），离心管，吸管（1毫升、5毫升、10毫升），玻璃涂棒。

2.培养基

（1）肉汤液体培养基：牛肉膏5克，蛋白胨10克，NaCl5克，蒸馏水1000毫升，pH7.0－7.2，高压灭菌15磅15分钟。

（2）加倍肉汤液体培养基（2E）：牛肉膏0.5克，蛋白胨1克，NaCl0.5克，蒸馏水50毫升，pH7.0—7.2，高压灭菌15磅15分钟。

（3）肉汤半固体培养基：肉汤液体培养基中加1％的琼脂。

（4）肉汤固体培养基：肉汤液体培养基中加2％的琼脂。

（5）半乳糖EMB培养基：伊红Y0.4克，美蓝0.06克，半乳糖10克，多胨10克，K2HPO42克，琼脂20克，蒸馏水1000毫升，pH7.0—7.2，高压灭菌8磅25分钟。

（6）Vogel50×基本培养基（浓缩50倍的基本培养基）：MgSO4·7H2O10克，柠檬酸100克，NaNH4HPO4·4H2O175克

K2HPO4500克，蒸馏水定容1000毫升（配好后放冰箱备用）。

（7）半乳糖基本固体培养基：Vogal50×2毫升，半乳糖2克，优质琼脂粉1.8克，蒸馏水98毫升，pH7.0，高压灭菌8磅25分钟。

（8）磷酸缓冲液：KH2PO42克，K2HPO47克，MgSO4·7H2O0.25克，蒸馏水1000毫升，高压灭菌15磅15分钟。

（9）生理盐水：NaCl8.5克，蒸馏水1000毫升，高压灭菌15磅15分钟。

（10）药品：氯仿。

四、实验说明

1.局限性转导可分为低频转导（LFT）和高频转导（HFT）。从低频转导的转导子中可分离得到用于高频转导的双重溶源化细菌，以双重溶源菌诱导制得λ噬菌体裂解液进行转导试验就称其为高频转导。

在低频转导中，用于转导的λ噬菌体大部分属正常的噬菌体（λ+），只有少数属部分缺失的转导噬菌体（λdggal+）。当大量噬菌体感染受体菌时，大部分受体菌被正常的噬菌体感染裂解死亡。尽管少部分被转导噬菌体感染，由于大量正常噬菌体的存在，往往同时也被正常噬菌体感染裂解死亡，一般认为：只有部分同时感染的细胞，首先λ+通过正常的附着位点整合到受体菌染色体上，然后，λdggal+的杂合附着位点和染色体上的杂合附着位点（由于λ+整合造成）再次整合形成不稳定杂基因子（双重溶源化细菌）整个过程见图15-2：

低频转导的转导频率较低，一般在106的感染细胞中有一个转导子出现。如改用双重溶源菌株进行诱导制备λ裂解液进行转导，情形就不同。由于λ+的存在使得λdg同时成熟，裂解液中就会出现50％正常噬菌体和50％部分缺失的λdggal+转导噬菌体，因此可以得到约50％的转导子，从而大大提高了转导频率。

2.λ溶源菌株的获得可通过较为简单的办法得到：用较高浓度的λ裂解液和用于转导的供体菌混合涂布于完全固体平板，同时做λ噬菌体和供体菌的对照。37℃培养过夜后，第二天就能看到混合涂布的平板出现单菌落，而对照涂布λ噬菌体平板无菌落、涂布供体菌平板呈现一片菌落。单菌落的出现是由于大量λ噬菌体把被感染的菌大都裂解掉，而只有少部分对λ噬菌体抗性菌落和λ溶源菌才能生长。只要区分这二种菌落，就能获得所需要的λ溶源菌株。一个简单的办法是把各个单菌落接种于一定体积的完全培养液中，37℃培养一定时间，然后离心除去上清液，用完全培养液制成菌悬液（菌液可浓一些，也可加入一定量的0.1mol/LCaCl2），各挑取一环菌液滴加于涂有菌液（对λ噬菌体敏感的指示菌）的完全固体平板上，然后以一定距离的U、V照射，37℃培养过夜，第二天观察是否有噬菌斑出现，如果噬菌斑出现，表明相应的单菌落是λ溶源菌，反之是λ噬菌体抗性菌。

同样，对低频转导的转导子进行上述的实验就能分离到高频转导的双重溶源菌，因为双重溶源的转导子经U、V照射也将会释放λ噬菌体感染敏感细菌而产生噬菌斑，相反，其它转导子经U、V照射不释放λ噬菌体不形成噬菌斑，这样我们将容易区分这种状态的转导子，而获得我们所需要的双重溶源性菌株。

五、实验步骤

1.噬菌体裂解液的制备

（1）前一夜挑取一环供体菌（K12（λ）gal+）接种于含有5毫升肉汤培养液的试管中，37℃培养过夜，然后吸取0.5毫升菌液于含有4.5毫升肉汤培养液的三角瓶中，继续培养3—4小时。

（2）将三角瓶的菌液倒入离心管，3500转/分离心10分钟。

（3）除去上清液，加4毫升磷酸缓冲液，制备菌悬液。

（4）取菌悬液3毫升于灭菌培养皿中，经U、V（15W、距离40厘米）处理，诱导10分钟。

（5）处理后加入3毫升2E肉汤培养液，37℃避光培养3－5小时。

（6）吸取培养液于灭菌离心管中，3500转/分离心10分钟，然后小心吸取上清液于另一支塞有软木塞的灭菌离心管中，加入0.2毫升氯仿（4—5滴），剧烈振荡半分钟，静止5分钟，小心把上清液用无菌吸管移入另一支灭菌试管（即λ噬菌体裂解液），供效价测定和转导用。

2.λ噬菌体的效价测定（λ噬菌体总数/毫升）

（1）前一夜挑取一环受体菌（K12gal-）接种于含有5毫升肉汤培养液的试管中，37℃培养过夜。

（2）吸取0.5毫升培养液于含有0.25毫升0.1mol/LCaCl2的4.5毫升肉汤培养液的三角瓶中，继续培养3—4小时。

（3）取已经熔化并于45℃保温的半固体琼脂试管（每管3毫升）4支，每支试管加入上述经活化后菌液0.5毫升。

（4）吸取λ噬菌体裂解液0.5毫升于含有4.5毫升肉汤培养液的试管中，依次稀释到10-6与10-7。

（5）从10-6和10-7试管中分别吸取0.5毫升于上述已加有菌的半固体试管中（每个稀释度2支），搓匀、分别倒入预先倒好并已凝固的肉汤固体培养基上，摇匀、待凝、37℃培养过夜。

（6）观察出现噬菌斑数，并估计λ噬菌体裂解液的效价（λ噬菌体数/每毫升）。

3.转导

A.点滴法：

（1）取预先倒好的EMB培养基二皿，在皿底用玻璃铅笔按下图的样子画好。

（2）取受体菌（经活化后菌液）一环，按上述图示涂二条菌带，37℃培养1.5小时。

（3）从温箱中取出培养皿，在二个圆圈和四个方格处，各滴加一环λ噬菌体裂解液（先滴加圆圈处再滴加方格处），圆圈处为λ噬菌体对照，方格处为转导试验，菌带为受体菌对照，37℃培养二天，观察结果。

B.涂布法：

（1）取预先倒好的EMB培养基四皿，其中一皿加0.1毫升λ噬菌体裂解液，用于对照；一皿加0.1毫升经活化后受体菌，也用于对照；另二皿加λ噬菌体裂解液和受体菌各0.05毫升。

（2）用3支灭菌玻璃涂棒涂布上述各组培养皿，37℃培养二天，观察结果。

C.平板注入法：

（1）将λ噬菌体裂解液用肉汤稀释为10-1、10-2、10-3、10-4，从各稀释度吸取2毫升裂解液于含有2毫升经活化后受体菌的离心管中，同时以只加λ噬菌体裂解液（2毫升10-1裂解液加2毫升肉汤培养液）和只加受体菌（2毫升经活化后受体菌加2毫升肉汤培养液）为对照。共六支灭菌离心管，37℃保温15分钟。
（2）取出上述6支离心管，3500转/分离心10分钟，弃上清液，打匀菌块，用生理盐水洗涤一次，3500转/分离心10分钟，弃上清液，打匀菌块，各加2毫升生理盐水制成菌悬液。

（3）从上述菌悬液中各吸取0.1毫升于预先倒好的半乳糖基本固体培养基中（转导各二皿，对照各一皿，共10皿），用六支灭菌玻璃涂棒涂布上述各组培养皿，37℃培养二天，观察结果，计算出现的转导子数。

六、实验结果