FISH步骤

yujian623

步骤：脱蜡 二甲苯,RT,3min*3
水化 乙醇100%,RT,3min*2
乙醇95%,RT,3min
乙醇75%,RT,3min
乙醇50%,RT,3min
PBS,RT,3min
变性 HCl(0.2mol/L),RT,20min
PBS,RT,3min
去蛋白 PK（100ug/ml),37 篊,20min
  PBS,RT,3min*2
后固定 4%PFA/PBS,RT,5min
  PBS,RT,3min*2
脱水 乙醇75%,RT,3min
乙醇95%,RT,3min
乙醇100%,RT,3min*2
干燥 RT,1h
预杂交 杂交液,50 篊,1h
杂交 变性探针,80 篊,10min-冰
稀释探针：1：80
滴片,湿盒,50 篊,18h
洗片 50% 甲酰胺+4xSSC,37 篊,30min
2xSSC,37 篊,15min*2
0.1xSSC,37 篊,15min
PBS,RT,3min
封闭 Washing buffer,RT,2min
Blocking buffer,RT,30min
10%马血清,RT,1h
免疫 Anti-DIG(1:500), 4 篊,12h
洗片 2X SSC+0.1% Nonidet P40,37 篊,4min*2
孵育 二抗-FITC, 湿盒,37 篊,30min
洗片 2X SSC+0.1% Nonidet P40,37 篊,4min*2
复染 PBS,RT,3min*2
Hochest,500ul,RT,5min
PBS,RT,3min*2
封片 抗淬灭封片剂
注意：标记二抗时要注意避光，防止荧光淬灭
  抗体反应过夜时可以在滴加的抗体上轻压一张干净的封口膜，防止液体流失